短枝条红型红富士苹果芽变的ISSR鉴定

张俊苗，李文胜，曹倩，史进

(新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)



短枝条红型红富士苹果芽变的ISSR鉴定

张俊苗，李文胜，曹倩，史进

(新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)

【目的】利用ISSR分子标记技术对选择的富士芽变优系和12个苹果品种为材料进行分子鉴定，构建指纹图谱，并且根据聚类分析的结果确定这13个苹果品种的亲缘关系。【方法】从100条ISSR引物中对供试样品进行PCR扩增筛选，采用NTSYSpc2.10t软件根据Nei’s遗传相似系数采用UPGMA法进行聚类，此分析亲缘关系，并采用POPGENE1.32软件计算多态性位点数、多态性点百分率，最终筛选出条带清晰、多态性较高、稳定且重复性好的引物。【结果】从100个ISSR引物中筛选出3个多态性高、重复性好的引物，分别为UBC846、UBC881和UBC899，共在57个位点扩增出条带，其中50个为多态性位点，平均多态性位点百分率为86.11%。利用3条多态性ISSR引物构建的数字化指纹能够有效地区分出所有供试材料，且建立了13个苹果品种的亲缘关系聚类图，这13个品种的相似系数的变化范围在0.67～0.82，表现出较高的遗传多样性。【结论】ISSR分子标记技术可以有效地用于苹果种质资源评价、指纹图谱的构建和苹果芽变品种的鉴定，为苹果的种质资源鉴定、遗传多样性检测和栽培育种提供了分子生物学依据。

红富士苹果；芽变；ISSR鉴定

0 引 言

【研究意义】DNA指纹图谱技术是通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在的表现规律[1]。由于直接以DNA的形式表现，其差异体现的是不同的基因型差异，因而更加准确、客观，因此是目前应用最为广泛的指纹图谱技术[2]。近年来，DNA分子标记技术的出现为在DNA分子水平上鉴定苹果品种提供了强有力的工具[3]。【前人研究进展】ISSR(inter-simple sequence repeats)标记是20世纪90年代中期发展起来的一种新型的分子标记技术[4]，具有多态性高、共显性、操作简便、稳定性好和重复性高等特点[5]，是一种可靠、快捷的分子标记技术，可用于大规模DNA指纹分析，在果树种质鉴定中发挥着重要的作用[6]。ISSR分子标记技术已成功用于梨[7]、李[8]、核桃[9]、葡萄[10]、枣[11]、杏[12]、柑橘[13]和苹果[14]等果树的品种鉴定、遗传多样性或指纹图谱构建等研究报道。宣继萍等[14、15]以富士苹果为材料对ISSR反应体系中的主要影响因子的最佳反应条件进行了探索，建立了适合于苹果的ISSR反应体系，并用两个引物将7个品种区分开来，初步证明利用ISSR分子标记技术能很好地将不同苹果品种鉴别出来；郭长奎等[16]用一个引物就将17个苹果品种清楚地鉴别出，表现出ISSR分子标记在品种鉴定和亲缘关系分析中的稳定性和可行性。【本研究切入点】短枝条红型芽变的ISSR鉴定研究文献较少，利用以优化好的ISSR反应体系，对12个苹果品种和芽变优系构建ISSR指纹图谱，并进行亲缘关系分析，该芽变优系经观察鉴定表明其生物学性状和主要经济性状稳定，是一个综合性状优良的短枝条红型的变异材料。【拟解决的关键问题】选用ISSR分子标记技术探讨苹果在DNA水平上的差异，寻找不同苹果品种的DNA特征谱带，分析其种质资源遗传多样性，为新品种的选育提供理论依据，为种质鉴定、亲缘关系分析等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料于2015年4月采自新疆阿克苏地区红旗坡农场苹果果园内，共13个品种：藤牧一号、青香蕉、红元帅、金冠、嘎啦、新红星、新世纪、天红2号、长富2号、富士芽变优系、乐乐、早熟富士、新红1号。材料均采于春季嫩梢萌动时期，采幼嫩健康无病斑的幼嫩叶片，置于盛有硅胶的自封袋中干燥，摇动使叶片与硅胶充分均匀接触，干燥过程中一旦发现硅胶从深蓝色变成粉红色时必须及时更换，将干燥好的材料带回实验室室温保存即可。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取采用CTAB法[17]，稍有改进，将浓度稀释到50 ng/μl，置于-20℃保存备用。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量和浓度。

1.2.2 引物筛选及扩增反应

PCR扩增选用的引物根据哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，PAGE纯化。对13个供试样品进行引物筛选，最终筛选出条带清晰、多态性较高、重复性较好的3个引物，其编号分别为UBC846、UBC881、和UBC899。

基本反应体系参照郭长奎[16]对17个苹果品种进行ISSR-PCR扩增时优化的体系，最终体系为：总体积为25 μL，含有双蒸水18.3 μL，10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，DNA模板50 ng，引物1 μL(浓度为10 mmol/L)，dNTPs2μL(浓度为2.5 mmol/L)，TaqDNA酶0.2 μL(浓度为5 U/μL)。扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s；54.2℃退火(因不同引物而定)45 s；72℃延伸2 min，反应40个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。

电泳及拍照：将制好的2%的琼脂糖凝胶浸入装有的缓冲液的电泳槽中，PCR扩增的产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分离。其电极缓冲液为1×TAE溶液，电压为120V，30～40 min；电泳结束后放入EB染色液中10 min，最后在紫外投射凝胶的成像系统中观察并拍照。

1.3 数据统计

对ISSR电泳胶图进行人工读带，按照DNA marker DL2000(100～2 000 bp)相同相对分子质量片段的有无进行统计。

根据PCR扩增产物的电泳结果，选取稳定性、重复性好的扩增条带进行统计分析。电泳图谱的每个DNA片段，为一个分子标记，代表一个引物的结合位点。根据凝胶上相对分子质量相同片段的有无进行人工统计，扩增出条带的记1，没有扩增出条带的记0，从而得到由1和0组成的二元数据的矩阵。采用POPGENE version1.32软件计算每个引物的多态性位点百分率和多态性位点百分数；相似系数及遗传距离用NTSYSpc2.10t软件计算，并以加权类平均法UPGMA进行聚类分析，构建各个品种的树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 芽变材料的鉴定与扩增多态性

从100个引物中筛选出3条引物的扩增结果表明，共扩增出57个位点，其中有50个多态性位点，引物的多态性点的百分率为73.33%～100%，平均多态性点百分率高达86.11%，扩增片段大小在200～2 000 bp范围内。每个ISSR引物扩增的条带数为15～22条，平均每条引物扩增出16.67个多态性条带，表现出所选的3个引物适于苹果品种之间遗传多样性的分析和指纹图谱的标记。其中引物899扩增出多态性条带最多，为22个，多态性位点百分率最高，为100%；其次是引物846，多态性位点百分率为85.00%；引物881的多态性百分率相对较低为73.33%。引物899、引物846和引物881对13个苹果品种的扩增结果，并能够清楚地将富士芽变材料和长富2号区别开。引物899扩增结果中长富2号在扩增片段大小950 bp，850 bp左右比芽变优系各多一条谱带；引物846扩增结果中长富2号在扩增片段大小600 bp左右比芽变优系多一条谱带；而引物881扩增结果中长富2号在1 800 bp扩增出清晰条带，芽变优系没有扩增出对应的条带；这3个引物芽变优系和长富2号扩增的条带差异较明显，证明芽变材料发生了较明显的遗传变异。表1，图1-3

图1 引物899在13份苹果品种的扩增图谱

M：DNA Marker DL2000；1藤木一号；2青香蕉；3早熟富士；4新世纪；5新红1号；6新红星；7金冠；8嘎啦；9天红2号；10乐乐；11红元帅；12长富2号；13富士芽变优系。下同

M：D2000Marker；1：Mato 1#; 2:Green banana; 3:Early fuji; 4:Xinshiji; 5:Xinhong1#; 6:Starkrimson; 7:Golden Delicious; 8:Gala; 9:Tianhong2#; 10:Lele; 11:Red delicious; 12:Nagafu2#; 13:Bud sports，the same as below.

图2 引物846在13份苹果品种的扩增图谱

图3 引物881在13份苹果品种的扩增图谱

2.2 ISSR指纹图谱的构建

根据引物846、引物881和引物899对13份供试苹果的扩增图谱中条带的有无或缺失用0和1进行数字化赋值，构成一个数字化的指纹图谱。列出了由3个引物扩增出的13个品种的数字指纹图谱，可以看出根据品种间的数字指纹谱的不同，将13个品种完全区分开来。表2

2.3 亲缘关系

利用3条ISSR引物的标记信息计算出材料间的遗传系数和遗传距离，得到各品种间的遗传相似系数介于0.67～0.82存在显著地遗传变异，平均相似系数为0.746，其中芽变优系和长富2号的遗传相似系数最高为0.82。基于UPGMA法构建的树状聚类图显示，在相似系数为0.67时，所有供试品种被分为两大类群，藤牧一号单独为一类；当相似系数为0.71时，供试品种可以分为3个主要类群，第二类群为杂类有：青香蕉、红元帅、新红星、金冠和嘎啦等5个品种；第三类群为富士类有：早熟富士、新世纪、新红1号、天红2号、乐乐、长富2号和芽变优系等7个品种。当相似系数为0.75时，第二类群又可分为两部分，金冠和嘎啦为一部分，青香蕉、红元帅和新红星为一部分。图4

表1 3个ISSR引物对13个供试苹果品种扩增

研究聚类结果与实际苹果品种间的亲缘关系基本相同。张传峰[18]研究表明天红2号的亲本是长富2号；郭长奎等[16]研究表明新红1号是长富2号的芽变品种，故天红2号和新红1号被聚在一起，相似系数为0.794。嘎啦是由元帅系的红基橙×金冠杂交而成，因此金冠和嘎啦被聚在一起，且遗传相似系数为0.774，显示出比较近的亲缘关系[19]。当相似系数为0.71时，第二类为富士类被分在一起，主要原因是这些品种都是由富士系芽变而来的，与富士有直接或间接的血缘关系，具有相同的遗传背景。但有些品种亲缘关系较远却有极相似的带型，如不属于元帅系的青香蕉却被聚在一起，可能是由于所用特异性引物不够多。当相似系数为0.794时青香蕉和元帅系的红元帅被聚类在一起，而新红星属于元帅系的芽变品种[19]，和红元帅的遗传相似系数为0.758，表明较近的品种间也存在复杂的遗传多样性，可能与自身品种在芽变过程中基因组发生较大的变化。表2，图4

表2 UBC846、UBC881和UBC899对13份苹果品种的特异性指纹

图4 13份苹果品种的UPGMA聚类树状图

3 讨 论

果树种质资源的鉴定和评价对于育种亲本选择、丰富遗传基础以及种质资源合理开发利用等方面都是非常重要的。但由于基因型与环境互作使以往根据形态学、生理学、染色体核型、同工酶标记等鉴定分类方法受到了很大的限制。而DNA分子标记中的ISSR分子标记技术具备高效、准确、不受环境及主观因素影响等特点。研究利用ISSR分子标记技术对构建的13个苹果品种的指纹图谱进行了分析，从100个引物中筛选出多态性高、重复性好的且对品种具有较高鉴别力的UBC846、UBC881、UBC899共3个引物。而引物899的扩增结果中，长富2号在分子大小950 bp，850 bp左右扩增出清晰的条带，而富士芽变优系没有扩增出对应的条带；引物846中长富2号在扩增片段大小600 bp左右比芽变优系多一条谱带；引物881中长富2号在片段大小为1 800 bp左右扩增出清晰条带，都说明短枝型芽变优系与长富2号相比发生了较明显的遗传变异，且利用筛选出的3个引物构建的聚类树状图表明芽变优系与长富2号的遗传相似系数最高，亲缘关系最近；这与郭长奎等[16]的研究结果一致，用一个引物证明长富2号在1 200 bp处比富士芽变优系明显多一个特异扩增带，说明富士芽变优系较长富2号发生了较明显的遗传变异。吴亚维等[20]用ISSR分子标记证明短枝芽变材料在210 bp扩增出清晰条带，而红富士母本在此位点没有明显的条带，表明短枝型芽变材料在DNA水平上发生了稳定的变异。研究涉及的富士芽变优系性状之一主要表现在枝条节间变短，在目前和将来短枝型品种是芽变选种的重要目标之一。宋杨[21]研究认为，苹果短枝型芽变‘龙富短枝’的GA20ox和KO的下调表达使植物体内GA含量降低，可能是枝条变短的主要原因，排除由于基因编码区的碱基突变、缺失、反转录转座子插入而导致的短枝型芽变。因此对该芽变初选优系进一步探讨短枝型芽变形成的机理和对芽变的分子机制的认识还有待深入，对苹果品种遗传改良具有重要意义。

根据供试苹果品种树状图的构建，聚类结果与传统谱系的亲缘关系基本相同。但在相似系数为0.794时红元帅和青香蕉聚在一起，可能的原因是检测的位点较少，不能完全代表整个基因组的情况，范付华等[22]在用ISSR分子标记对23个水稻品种进行亲缘关系分析时也出现过同样的情况。因此ISSR分子标记方法虽然是一种多态性高、重复性好的指纹图谱的构建方法，但由于它也是一种基于PCR的分子标记，对反应条件较敏感，所以必须保持严格一致的反应体系和扩增程序才能保证结果的可靠性[23]，如果能与品种的染色体核型、同工酶标记等互为补充，则可以更好地为苹果的管理、保护及品种登录提供依据。

4 结 论

通过利用ISSR分子标记技术对13个苹果品种的亲缘关系进行分析和分类，品种间的遗传相似系数幅度变化较大，变化范围在0.67～0.82，同时通过3条引物扩增的谱带可准确地将13个苹果品种鉴别出，并从DNA分子水平上证实了富士短枝型芽变优系与长富2号相比发生了较明显的遗传变异，结合植物学特征、生物学特性的研究观察，认为芽变优系为在DNA上发生了稳定的变异，且综合性状明显优于长富2号。ISSR作为一种分子标记，能较好地从分子水平上解释苹果品种资源间的遗传多样性，同时也证实了ISSR分子标记技术在苹果品种鉴定中的高效性和有效性，为富士优良品系的发展和鉴定提供科学依据，指导苹果种质资源的品种选育与合理开发利用。

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ISSR Identification of Bud Mutation of Spur and Red Stripe Fuji Apple

ZHANG Jun-miao, LI Wen-sheng, CAO Qian, SHI Jin

(College of Forestry and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

【Objective】 This project aims to do molecular identification of bud sprouts of the Fuji apples and 12 apple cultivars chosen and construct the fingerprint by using ISSR molecular markers technique, and according to the result of clustering analysis to determine the genetic relationships of the 13 apple cultivars.【Method】From 100 ISSR primers on the tested samples for PCR amplification and selection, using NTSYS-pc2.10t according to Nei's genetic similarity coefficient UPGMA clustering, in order to analyze the genetic relationship. The number of polymorphism and the percentage of polymorphic loci were calculated by POPGENE 1.32 and eventually were screened out with clear stripe, rich polymorphism, repeatability, and the varieties with high resolution.【Result】Four ISSR primer pairs with high polymorphism and good repeatability were selected from 100 ISSR primer pairs, and they were named as UBC846, UBC881 and UBC899. Four primer pairs produced 57 loci, which 50 were polymorphic. The percentage of polymorphic loci was 86.11%. Three polymorphic ISSR primers used to construct the digital fingerprint could effectively distinguish all the materials, and establish the phylogenetic relationships of 13 apple varieties. The similarity coefficient of the 13 varieties ranged between 0.67-0.82, showing a higher genetic diversity.【Conclusion】ISSR molecular marker technology can be effectively used to identify apple germplasm resources evaluation, fingerprint construction and bud mutation varieties identification and it is suitable for the germplasm identification and genetic relationship analysis of apple, thus providing a biological theoretical foundation for breeding and cultivation.

Red Fuji; bud mutation; ISSR identification

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.008

2016-02-15

国家林业公益性行业科研专项课题“新疆特色林果优良品种选育和推广”(201304701-1)；自治区特色林果发展专项林木遗传育种项目(2014年)

张俊苗(1989-)，女，江苏人，硕士研究生，研究方向为果树种质与资源，(E-mail)839141787@qq.com

李文胜(1968-)，男，湖南人，副教授，硕士生导师，研究方向为果树种质与资源，(E-mail)252500755@qq.com

S661.1

A

1001-4330(2016)07-1230-07