Kartogenin与TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX对兔滑膜间充质干细胞增殖及成软骨分化的对比研究

谢金硕 周义钦 陈松 邵加华 符培亮 许震宇 吴海山

Kartogenin与TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX对兔滑膜间充质干细胞增殖及成软骨分化的对比研究

谢金硕 周义钦 陈松 邵加华 符培亮 许震宇 吴海山

目的 比较Kartogenin（KGN）与转化生长因子β3（TGF⁃β3）/骨形态发生蛋白2（BMP⁃2）/地塞米松（DEX）对兔滑膜间充质干细胞（synovial⁃derivedmesenchymal stem cells,SMSCs）增殖及成软骨分化的作用。方法 于6～10月龄新西兰大白兔膝关节处滑膜中分离培养SMSCs，并进行鉴定。设置KGN组（采用KGN干预）、T/B/D组（TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX联合干预）及空白对照组，采用PELLET系统培养法分别培养各组细胞。通过比较各组细胞的增殖速度、软骨微球的直径和重量、Ⅱ型胶原（Col⁃Ⅱ）表达情况、成软骨分化相关标志基因表达及蛋白质合成量等指标来评价KGN对SMSCs增殖及成软骨能力的影响。结果 成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs；KGN组的SMSCs增殖能力弱于T/B/D组，但KGN组软骨微球直径最大，重量最重，Ⅱ型胶原合成量最多，且均显著高于其他组；PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分化相关基因的表达最强，蛋白质合成量最多。结论 KGN不能明显增强SMSCs的增殖能力，但对SMSCs的成软骨分化能力强于TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX，将来可能应用于修复软骨损伤。

滑膜；间质干细胞；细胞增殖；细胞分化；软骨细胞；转化生长因子

滑膜间充质干细胞（synovial⁃derivedmesenchy⁃ mal stem cells,SMSCs）是一种关节滑膜源性的组织特异性的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）［1］，具有很强的成软骨分化能力［2］，而众多细胞因子参与这一过程并起到关键作用。多项研究报道，转化生长因子β3（transforming growth factor⁃β3, TGF⁃β3）、骨形态发生蛋白2（bonemorphogenetic protein⁃2,BMP⁃2）、地塞米松（dexamethasone,DEX）

是促肝细胞成软骨分化的常用因子，并且三者联合体外诱导SMSCs成软骨分化比单一因子或两两联合的诱导效率都要高［3⁃6］。

Kartogenin（KGN）是一种新的小分子化合物，2012年由Johnson等［7］在22 000多种不同结构的药性化学分子中筛选出来，他发现KGN不仅对骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells, BMSCs）有着很强的成软骨分化能力，还能促使BM⁃SCs单一地向软骨细胞分化。KGN对BMSCs的诱导效率与浓度相关，10μmol/L的KGN促软骨分化能力最强，并且在修复受损软骨时可减少再生软骨的表层及中层纤维化，生物安全性良好［7］。自KGN被发现以来，相关研究主要针对BMSCs，而对具有组织特异性的SMSCs几乎没有研究［7⁃9］。体外实验研究几乎都是以二甲基亚砜（DMSO）作为空白对照组，缺乏有说服力的阳性对照，并不能反映KGN成软骨分化能力的强度。

本实验在已有的研究基础上，分离培养鉴定兔滑膜SMSCs，采用PELLET系统培养法，设立阳性对照（TGF⁃β3/BMP⁃2/DXM）及空白对照（DMSO或完全培养基），通过检测软骨微球的性质、软骨细胞相关基因表达情况以及成软骨细胞分化过程中相关蛋白的表达情况，来分析KGN对SMSCs成软骨细胞分化的影响及其程度。

材料与方法

一、主要试剂、仪器和实验动物

1.主要试剂 戊巴比妥钠（Sigma公司，美国），胎牛血清、DMEM、液体培养基（Gibco/BRL公司，美国），0.25%胰蛋白酶/EDTA、Ⅰ/Ⅱ型胶原（Monosan公司，美国），KGN粉剂、免疫荧光试剂盒［赛业（广州）生物科技有限公司，中国］，小鼠抗人、羊抗鼠单克隆荧光标记抗体（BD公司，美国），RneasyMiniKit试剂盒、Western Blot试剂盒、DMSO（上海浩然生物技术有限公司，中国），TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX（Sigma公司，美国）。

2.主要仪器 SBD 50恒温水浴摇床（Heto公司，丹麦），CO2培养箱（Thermo Forma，美国），SMZ 645型光学显微镜（Nikon公司，日本），IX70型荧光显微镜（Olympus公司，日本），流式细胞仪（BD公司，美国），流式结果分析软件CellQuest（Becton Dickinson公司，美国），超净工作台（苏州智净净化设备有限公司，中国），超低温冰箱（Forma Scientific公司，美国）。

3.实验动物 新西兰大白兔4只，月龄6～10个月，雌雄不限，体重1.6～2.2 kg（第二军医大学动物实验中心提供）。

4.分组 设立KGN组（浓度为10μmol/L）、T/B/ D组（10μg/m l的TGF⁃β3、0.5mg/m l的BMP⁃2、100 nmol/L的DXM）以及空白对照组（含2%胎牛血清的DMEM完全培养基或DMSO）。

本研究获第二军医大学医学伦理委员会批准。

二、兔SMSCs的观察及鉴定

（一）细胞分离、培养

新西兰大白兔4只，兔膝关节活检术收集兔膝关节处滑膜，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，离心10 min，吸净上清，加入DMEM完全培养基，在37℃、5%CO2环境下培养。光学显微镜下连续观察细胞生长和形态学特征，每隔1 d换液1次。培养至90%融合时，按1∶3比例传代。

（二）细胞表面抗原鉴定

取传代至第3代贴壁生长的SMSCs，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1 600 r/min离心10min，细胞重悬并使其密度约为每毫升2×106个，然后取0.1ml待测细胞悬液，加入不同单克隆抗体（CD44、CD45、CD90、CD105），避光常温条件下反应30min。收集待检细胞，多聚甲醛固定液200ml，对待检细胞进行标记物检测。

三、促增殖能力的比较

将粉末状的KGN充分溶解在DMSO中，配制成1mmol/L的KGN初始液，进而稀释至10μmol/L。将分离获得的第3代SMSCs以1 000个/孔的密度接种于96孔培养板中。分别加入对应组的干预试剂，连续培养3 d后，向每孔中加入CCK⁃8试剂10μl，继续培养4 h，使用分光光度仪检测每孔波长为450 nm的吸光度A值，计算相对增殖速率。

四、成软骨分化能力的比较

（一）软骨微球的相关检测

将分离培养的第3代SMSCs通过体外PELLET系统法进行扩增培养，EDTA消化吸收，通过细胞计数调整细胞浓度为每毫升2×105个接种于9个15ml的离心管中。每组3支SMSCs离心管，分别加入对应组的干预试剂。1 000 r/min离心15min后，取出离心管放置在预先设定好的37℃、5%CO2的温箱中培养21 d。

1.检测软骨微球的直径和重量 PELLET系统下，在各组成软骨细胞系分化21 d后，测量各组形成的软骨微球直径；在各组成软骨细胞系分化过程中，

分别在第7、14、21天时，使用重量测量仪检测各组软骨小球的重量。

2.观察蛋白聚糖表达情况 培养21 d后，取各组细胞，清洗后以4%多聚甲醛固定30min，石蜡包埋切片，切片厚度为5μm，脱蜡蒸馏水冲洗，甲苯胺蓝染色，倒置显微镜下观察蛋白聚糖的表达情况。

3.分析Ⅱ型胶原（Col⁃Ⅱ）的表达情况 ①各组SMSCs成软骨细胞系分化21 d后，于PELLET系统培养管取出软骨微球，吸净培养基，PBS冲洗液清洗2次，4%多聚甲醛溶液完全浸泡30min；②待完好固定后，使用细胞封闭液对各组SMSCs非特异性结合位点封闭反应20min；③按试剂盒中说明进行操作，结束后拍照。

（二）RT⁃PCR分析成软骨分化标志基因的表达

检测成软骨分化标志基因Sox9、aggrecan、Col⁃Ⅱ）的表达情况。

将分离培养的SMSCs细胞，以1×105个/孔的密度种植在6孔培养板中，先给予各孔基础培养液，每组3孔，分别加入对应组的干预试剂。

成软骨细胞系分化14 d后，对各组SMSCs先用胰蛋白酶/EDTA消化分离贴壁细胞，除去上清液，收集各组细胞团块，37℃下用3mg/ml胰腺酶溶解消化3 h。Trizol提取总RNA，以总RNA为模板，行逆转录，反应条件为70℃5min，42℃1 h，95℃10 min。PCR反应条件为94℃5min；94℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，30～35个循环；72℃延伸5min。相关引物序列详见表1。

（三）分析成软骨分化相关蛋白的表达

采用Western Blot分析相关蛋白。在100 V的恒压下电泳60min；在200mA的恒流下采用半干转膜法持续90min。室温下封闭1 h，4℃一抗孵育过夜，TBS洗膜3次，每次10min，室温下二抗孵育2 h，TBS洗膜3次，每次10min，滴加ECL显色液，观察并拍照。

五、统计学方法

表1 成软骨分化标志基因的引物序列

结果

一、细胞观察及鉴定

（一）SMSCs的细胞学观察

SMSCs刚刚接种时，显微镜下可见大量杂乱的形态不规则的细胞，1 d后可见杂乱的细胞向周围培养液爬行，并出现沿器皿壁生长的细胞，随着细胞培养，镜下细胞形态各异，大部分为椭圆或多边形，细胞透亮度高（图1 a）；随着时间延长，镜下见细胞数量急剧增多，密度变大，细胞形态有一定的规则和一致性，肥大的细胞核消失，多边形外观消失，出现了菱形和星形的细胞（图1 b）；继续传代扩增培养后，第3代SMSCs细胞形态基本上达到了规则一致性，细胞呈细梭形状满整个视野（图1 c）。

（二）流式细胞仪检测细胞表面抗原

运用流式细胞仪检测第3代培养的待测细胞表面抗原发现：CD44、CD105、CD90呈阳性表达，而CD45表达呈阴性（图2），与SMSCs表面抗原表达特

征相符。

图1 细胞接种1 d（a）、7 d（b）、14 d（c）时显微镜下的细胞形态（×100）

图2 流式细胞仪检测样品细胞表面抗原 CD44、CD90、CD105呈阳性表达，而CD45表达呈阴性

二、对SMSCs增殖的影响

细胞扩增培养3 d后，T/B/D组SMSCs的增殖速度明显高于其他两组，差异均有统计学意义（均P＜0.05，图3）。KGN组与空白对照组相比，增殖速度差异没有统计学意义（P＞0.05，图3）。

图3 三组中SMSCs的增殖情况（与空白对照组比较，*P＜0.05；与T/ B/D组比较，#P＜0.05）

三、对SMSCs成软骨分化的影响

（一）软骨微球相关检测

1.微球的直径 成软骨细胞系诱导分化21 d后，KGN组和T/B/D组中软骨微球的直径较空白对照组明显增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）；而KGN组软骨微球的直径显著大于T/B/D组，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。

2.微球的重量 成软骨细胞系诱导分化7、14、21 d，随着时间的延长，各组软骨微球重量都有所增加，KGN组、T/B/D组的软骨微球重量明显高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；KGN组软骨微球重最重，与T/B/D组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。

（二）各组成软骨分化蛋白聚糖的表达

成软骨细胞系诱导分化21 d后，KGN组较T/B/ D组甲苯胺蓝染色更深，密度更密（图6）。

图4 各组成软骨诱导21 d后软骨微球的直径（与空白对照组相比，*P＜0.05；与T/B/D组相比，#P＜0.05）

图5 三组成软骨分化各时间点软骨微球重量的比较（与空白对照组相比，*P＜0.05；与T/B/D组相比，#P＜0.05）

（三）免疫组织化学染色检测Col⁃Ⅱ表达

成软骨分化21 d，KGN组与T/B/D组均有Col⁃Ⅱ表达，而空白对照组未见Col⁃Ⅱ表达。KGN组Col⁃Ⅱ较T/B/D组更密集（图7）。

四、RT⁃PCR分析成软骨分化标志基因的表达

RT⁃PCR的检测结果显示，KGN组与T/B/D组均有成软骨分化相关基因Sox9，aggrecan、Col⁃Ⅱ的表达，但KGN组成软骨细胞分化相关基因表达更多（图8）。

图6 各组细胞成软骨分化21 d后（甲苯胺蓝染色） KGN组（c）较T/B/D组（b）染色更深，密度更密，a为对照组

图7 各组细胞Col⁃Ⅱ免疫组织化学染色结果（×100） KGN组（c）与T/B/D组（b）均有Col⁃Ⅱ表达，KGN组表达更强，而空白对照组（a）未见表达

图8 成软骨分化相关基因表达情况（与对照组相比，*P＜0.05；与T/ B/D组相比，#P＜0.05）

图9 各组成软骨分化蛋白合成情况

五、Western Blot分析成软骨分化相关蛋白

KGN组与T/B/D组均有成软骨分化相关蛋白Sox9、aggrecan、Col⁃Ⅱ的合成，并且均高于空白对照组，KGN组相关蛋白合成量更多（图9）。

讨论

SMSCs作为MSCs的一种，具有增殖速度快以及可多向分化等能力［10］，而且是一种关节滑膜源性的组织特异性的MSCs［1］，与骨髓、脂肪和肌肉等分离的MSCs相比，有更强的成软骨分化能力［2］。

Eslaminejad等［11］在体外诱导BMSCs成软骨分化过程中，通过检测Sox9、aggrecan、Col⁃Ⅱ等相关软骨标志发现TGF⁃β3较TGF⁃β1体现了更强的成软骨分化能力。随后有研究学者发现，TGF⁃β除了有促进成软骨分化作用外，还可以促进SMSCs迁移归巢，从而进行软骨原位修复［12］。Ichinose等［13］发现TGF⁃β3、BMP⁃2、DEX三者联合体外诱导SMSCs向软骨细胞转化时，随着培养时间的延长，SMSCs体积及其重量在不断增加。本研究中也有相似发现。

Johnson等［7］发现不同浓度（10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的KGN对BMSCs向软骨细胞分化的能力不同，以10μmol/L KGN的结果最为显著，但是各浓度对生物体均无副作用。同时，在进行了为期21 d的软骨小球培养后，他们发现，在

加入KGN后，Col⁃Ⅱ和聚集蛋白聚糖含量均增多。本实验通过与T/B/D进行对比，探究KGN对SMSCs成软骨分化的影响，所以直接采用10μmol/L KGN作为实验组，并未设置浓度梯度。研究结果发现KGN组蛋白聚糖、Col⁃Ⅱ以及成软骨分化相关基因及蛋白表达均强于T/B/D组，而且软骨微球染色蛋白聚糖含量最多，与Johnson等［7］的发现相似。

Zhang等［14］发现随着KGN浓度的逐步提高，BMSCs中成软骨分化相关基因Sox9、aggrecan、Col⁃Ⅱ的表达逐渐增强，KGN浓度为10μmol/L时，Sox9的表达可提升3倍左右。Shi等［15］发现KGN体外可以促进人来源SMSCs向软骨细胞分化。本研究也有相似的发现。

本研究也存在不足，由于未设立KGN浓度梯度，无法探讨不同浓度KGN对SMSCs的影响。而且，本研究只进行了体外细胞实验，下一步将在体内通过KGN联合支架材料，探索KGN对软骨损伤修复能力，为临床软骨修复提供新的方法。

综上所述，本研究成功从新西兰大白兔膝关节处分离获取了SMSCs，并对其进行了鉴定。在前期研究的基础上，我们将高浓度KGN与TGF⁃β3/BMP⁃2/DXM进行对比研究，并设立空白对照组，探索KGN对SMSCs成软骨细胞分化的影响，借助软骨微球相关检测，PCR以及Western Blot等相关检测方法，分析各组成软骨能力的强弱，结果显示KGN组诱导SMSCs成软骨分的能力强于T/B/D组，为SMSCs修复软骨损伤奠定基础。

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A comparative study of effects of kartogenin vs.TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX on proliferation and chondro⁃genic differentiation of rabbit synovialmesenchymal stem cells.

XIE Jinshuo*,ZHOU Yiqin,CHEN Song, SHAO Jiahua,FU Peiliang,XU Zhenyu,WU Haishan.*Department of Joint Center,Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai200003,China

WUHaishan,E⁃mail:drisland@vip.sina.com

Objective The effectof kartogenin(KGN)on chondrogenic differentiation of rabbitsyno⁃vial mesenchymal stem cells(SMSCs)was evaluated by comparing with TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX.Methods SMSCs were isolated from the knee joints of rabbits,and cultured in the PELLET system for chondrogenic differentiation.The cell pellets were divided into 3 groups:KGN group(given KGN),T/B/D group[given the combination of transforming growth factor⁃β3(TGF⁃β3),bonemorphogenetic protein⁃2(BMP⁃2)and dexametha⁃sone(DEX)],and blank controlgroup.The cellmultiplication,diameter,weight,collagen typeⅡ,expression of cartilage related genes and protein synthesis of cell pellets in each group weremeasured to analyze the effect of KGN on the proliferation and chondrogenic differentiation of SMSCs.Results SMSCs were successfully isolated from the knee joints of rabbits.The ability of proliferation of pellets in KGN group was significantly weaker than that in TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX group.The pellets in KGN group presented larger diameter,heavier weight,more collagen typeⅡand higher expression of cartilage related genes and protein synthesis than those in the other groups.Conclusion KGN could not enhance SMSCs’proliferation,butmore strongly induce SMSCs’chondrogenic differentiation than TGF⁃β3/BMP⁃2/DEX.For this reason,KGN could be used as a new method for repairing cartilage in the future.

Synovial membrane;Mesenchymal stem cells;Cell proliferation;Cell differentiation; Chondrocytes;Transforming growth factors

2016⁃04⁃05）

10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.05.013

上海市自然科学基金项目（15ZR1414000）

200003 上海，上海长征医院关节外科（谢金硕、周义钦、陈松、邵加华、符培亮、吴海山）；第二军医大学组织胚胎教研室（许震宇）

吴海山，E⁃mail：drisland@vip.sina.com