重组酶聚合酶扩增技术的研究进展

刘冬虹　王德莲　郭燕华　聂炎炎　吴　环　曾国权

（广州质量监督检测研究院　广东广州　511447）

重组酶聚合酶扩增技术的研究进展

刘冬虹王德莲*郭燕华聂炎炎吴环曾国权

（广州质量监督检测研究院广东广州511447）

重组酶聚合酶扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的新技术。与传统PCR及等温扩增技术相比较，其最显著的优势是在25℃-43℃条件下，5-20 min内观察到检测结果，且操作简单，设备成本低廉，被认为是一种可以代替PCR的新技术。本文综述了重组酶聚合酶扩增技术的原理和特点、检测方法及近十年来在国内外不同领域的应用情况，并展望了该技术在检测领域中的未来方向。

重组酶聚合酶扩增技术；检测方法；应用领域

1　前言

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，简称RPA）是由国剑桥Babraham研究院成立的TwistDx生物技术公司发明的一种体外核酸等温扩增检测新技术，既可以检测DNA[1，2]，也可以检测RNA[3，4]。由于与聚合酶链式反应（PCR）技术相比较，具有成本低、耗时短、操作简单、不受检测场地限制等优点，因此RPA技术被认为是可以替代PCR的核酸检测技术而受到广泛关注，成为分子检测技术研究的热点之一。自2006年问世以来，该技术已取得长足的发展，并被应用在多个检测领域。

2　RPA技术的原理和特点

2.1技术原理

RPA技术以T4噬菌体核酸复制机制为原理[2]，利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物和模板的特异结合。反应体系主要有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY[5]、单链结合蛋白gp32及BsuDNA聚合酶、引物、模板、缓冲液等[2]。

在恒温下，重组酶蛋白在ATP的参与下与单链核酸（引物）结合形成蛋白-核苷酸复合物，该复合物可以在双链DNA（模板）上进行双向扫描，寻找与引物同源的靶序列，一旦找到，重组酶可打开双链DNA，同时引物与同源序列发生链交换反应，在DNA聚合酶的作用下启动DNA合成反应。单链结合蛋白与被引物替换掉的母链结合，防止被进一步替换。在这个体系中，由一对相对的引物同时启动和完成一个合成过程，合成的子代DNA继续重复整个合成过程，目标序列形成指数式增长，整个过程进行非常快，一般可在20 min内获得可检出的扩增产物[6-9]。

图1　RPA核酸扩增原理简图

2.2技术特点

RPA技术与其他DNA检测技术相比较主要有以下几个特点：

（1）在恒温条件下进行核酸的扩增。与PCR技术相比较，RPA技术最大的一个特点是不需要在较高的温度循环下对模板DNA进行变性和扩增，而只需要在25℃-43℃条件下利用特殊的酶打开模板链，完成对核酸的扩增。与其他的等温扩增技术[10-14]，如链替代扩增（SDA）、滚环扩增技术（RCA）、依赖解旋酶等温扩增技术（HAD）、依赖核酸序列的扩增（NASBA）、环介导等温扩增（LAMP）等相比较，SDA、RCA、HAD以及LAMP等均需要在65℃下进行退火，且LAMP技术对扩增靶序列的长度最好控制在300 bp以下，对引物的要求高，由在线引物设计软件设计出的引物有上千条，要筛选出合适的引物需要耗费大量工作；NASBA只能用于检测RNA。除此以外，它们都需要较长的反应时间和特殊的仪器设备等。

（2）耗时短。RPA技术的最大优点之一就是检测时间短，整个反应在5-20 min就可完成检测，远快于其他等温扩增技术或PCR技术。

（3）操作简单。RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，仅需加入引物和模板即可反应。在这个基础体系中加入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA检测，如实时荧光定量RPA、横向流动试纸条检测。除此以外，TwistAmp®Basic RT添加了逆转录酶，可以对RNA模板进行一步法扩增。

（4）成本低。与传统的PCR相比较，由于RPA技术不需要专门的PCR仪等设备，只需一般的恒温设备便可进行检测，大大降低了检测成本。

（5）不受检测场地的限制。RPA技术对检测设备要求低，甚至可以利用人体腋窝的温度对样品进行检测[15]，且灵敏度高，不需要对样品进行复杂的前处理，特别适合无法进行核酸抽提的实地检测。而其他的检测方法均需要核酸抽提。

（6）高灵敏性和特异性。RPA灵敏度高，能够将痕量的核酸模板（1-10拷贝）扩增到可以检出的水平[2，16]；其特异性与实时荧光PCR无差异[17]。

3　RPA产物的检测方法

3.1凝胶电泳检测

RPA基础反应体系除了需要添加重组酶、单链DNA结合蛋白外，其余体系与PCR相同。RPA扩增可以在任何恒温设备中进行，根据不同的扩增目标，选择合适的温度，一般在37℃条件下20 min便可得到目的片段。为避免扩增产物在凝胶电泳检测时出现拖尾现象，需要对扩增产物采用酚-氯仿抽提后进行琼脂糖凝胶电泳，经EB染色，在紫外光照射下对目的条带进行检测。该检测方法操作简单，对比需要6-8条引物才能完成扩增的LAMP方法，RPA技术仅需一对引物即可完成扩增，且灵敏度不低于LAMP等温扩增技术[18-20]，因而更加适用于核酸的检测。目前，该方法已在转基因水稻的检测中得到应用[21]。

3.2实时荧光定量RPA

在RPA扩增体系中加入一个荧光标记的探针便可实现模板扩增的实时检测，该探针在胸腺嘧啶上分别携带一个荧光基团和一个淬灭基团，中间由一个四氢呋喃（THF）隔开。当探针与扩增产物结合时，核酸外切酶III识别THF碱基位点，将荧光基团和淬灭基团分开，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步。使用便携式荧光检测仪便可在10-20 min内检测到荧光曲线，其灵敏度可达到1-10个拷贝[2，16]。该方法已在疾病防控[3]、食品安全[1]等检测领域得到应用。

3.3横向流动试纸条（RPA-LFD）检测

RPA试纸检测方法结合了免疫技术、分子杂交技术、胶体金技术及侧向流层析技术，其原理为生物素标记的核酸扩增产物可以和FAM标记的特异探针杂交。该探针长约50个碱基，在其5′端标记FAM，探针的中间同样设计一个脱碱基位点，大肠杆菌核酸外切酶nfo可以识别该位点并切开磷酸二酯键，产生自由的羟基端，DNA聚合酶便可在此进行延伸；3′端的引物可以用生物素标记。最终扩增产物的5′端为FAM标记，3′端为生物素标记。FAM标记的特异探针与抗FAM抗体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线。由于该方法特异性好，检测时间短，一般5-15 min便可通过肉眼判读结果，已在细菌、病毒、寄生虫、转基因等领域得到了广泛应用[22-26]。需要注意的是，在用该方法进行检测时，需要稀释RPA反应的产物。否则，RPA反应中的一些物质可能会干扰试纸上的抗体，出现非特异性和假阳性结果。

4　应用领域

作为一种新的核酸检测技术，RPA技术已逐渐用于生命科学领域。Abd El Wahed等[4]应用RTRPA技术建立了中东呼吸综合征冠状病毒的快速检测方法，该方法操作简单，高效灵敏，可在3-7 min之内检测到107-101个拷贝的RNA分子，而传统的RT-PCR方法则需要2 h。且该方法所使用的便携式检测装置仅重约1 kg。Nahed Yehia等[27]利用RT-RPA方法检测流感病毒H5N1 HA基因，可在7 min内检测到1个拷贝的RNA分子，且与实时荧光PCR具有同等的高灵敏度和高特异性。RT-RPA方法还被应用在植物病毒的检测中，Tefera[28]等建立了樱桃小实病毒的RT-RPA检测方法，同时通过实验证明了RT-RPA方法与RT-PCR方法具有同样的高灵敏度。此外，RT-RPA方法还被用于手足口病、登革热、新生牛腹泻日冕形病毒、虾病毒的检测等。越来越多的研究证明，RT-RPA技术在病毒的检测方面显示了巨大优势，具有巨大潜力。

RPA作为一种常温的快速DNA扩增法，为资源匮乏的地区提供了检测结核病（TB）的简便工具。研究人员在RPA的基础上，快速检测了结核分枝杆菌复合群MTC的DNA（IS6110和IS1081）。在39°C环境下，RPA检测能在20 min内得出高灵敏度的结果。进一步研究表明，在检测TB感染者的肺部样本时，RPA检测比荧光显微镜检测还要准确[29]。

RPA技术在食品安全检测领域也显示出了巨大潜力。中国农业科学研究院生物技术研究所的团队通过RPA技术实现了转基因作物的快速检测，通过设计Camv35S和NOS的RPA引物，对转基因作物进行筛选和检测，在15-25 min内检出了含有100拷贝目标分子的样本。此外，他们还建立了实时RPA分析体系，成功检测了4种主要的转基因作物（玉米、水稻、棉花和大豆）[26]。同时，将RPA技术与酶联免疫相结合形成的RPA-ELISA方法还用于食品中过敏原性成分、转基因成分、致病菌、真菌的检测等。

RPA技术还广泛的应用于恶性疟原虫[30]、立克次体、支原体等病原体检测[31]以及水产养殖中水质的检测[32]等。

5　小结与展望

RPA 技术作为一种新的恒温扩增技术，具有反应时间短、灵敏度高、操作简单等独特的优越性，引起了生物学家的广泛关注。与该技术相结合发展起来的实时荧光定量RPA、RPA-LFD、RPA-ELISA等检测方法已广泛应用于诊断、医疗、农业、食品安全等领域。作为一种新技术，尽管还存在一些缺点和不足，如引物和探针的长度较PCR技术的要长，且引物和探针的设计和筛选还没有相关的软件可以辅助等。但是它仍然被看做是可以替代PCR的核酸检测技术，随着研究的深入，该技术也会不断成熟，在更多的领域体现它的价值。

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Adavances in Recombinase Polymerase Amplification

LIU Donghong，WANG Delian*，GUO Yanhua，NIE Yanyan，WU Huan，ZENG Guoquan
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou，Guangdong，511447）

Recombinase Polymerase Amplification（RPA）is a new kind of technique which can make micro-nucleic acid to be efficiently and rapidly amplified in vitro.Compared with the traditional techniques e.g.，polymerase chain reaction（PCR）and isothermal DNA amplification，RPA can easily observe the test results under the condition of 25℃-43℃in 5 to 20 minutes.Due to its convenient operation and low cost，RPA has been considered as a new technique which can replace PCR.In this review，the principle，characteristic，detection method of RPA，and its application in different fields at home and abroad in the last decade are summarized.The application of RPA in inspection field is also prospected.

Recombinase Polymerase Amplification Techenique；Detection Method；Application Area

Q789

E-mail：1204051393@qq.com；*通讯作者E-mail：dlwang2003@126.com

广东省质量技术监督局科技项目（2016CZ11）

2016-03-25