分子生物学方法鉴定新资源食品中乳杆菌

薛晓晶　张焱鑫　陈会君　马洁　王芳　芦云

（中国检验检疫科学研究院　北京　100123）

分子生物学方法鉴定新资源食品中乳杆菌

薛晓晶张焱鑫陈会君马洁王芳芦云

（中国检验检疫科学研究院北京100123）

采用16S rDNA扩增同源性分析、16S rDNA PCR-RFLP技术、种特异性序列扩增技术，对新资源食品中的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum进行鉴定分析。结果表明，16S rDNA扩增同源性分析能够有效鉴定嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌，无法区分副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；16S rDNA PCR-RFLP技术可以有效鉴定嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌；种特异性序列扩增能够有效鉴定副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。结合检验工作需要，运用以上方法可以对食品安全国家标准中生化鉴定法难以确认的乳杆菌进行有效鉴别。

新资源食品；乳杆菌鉴定；16S rDNA；RFLP；种特异性扩增

1　前言

自2007年以来的近10年间，我国卫计委（原卫生部）颁布了13条公告[1-9]，批准12种乳酸菌作为新资源食品或新食品原料，其中包括6种乳杆菌（鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilus、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum）。

在行业标准中[10]，分子生物学鉴定技术已可用于乳杆菌属的鉴定，但目前还没有采用此类技术进行食品中乳杆菌菌种鉴定的标准出台，这给食品检测中乳杆菌菌种鉴定工作带来了很大的压力。即使是标准中明确可以检测的乳杆菌，在进行传统生化鉴定时也存在问题，例如GB 4789.35-2010[11]中给出的干酪乳杆菌干酪亚种Lactobacilluscasei subsp. casei、鼠李糖乳杆菌以及标准中没提及的副干酪乳杆菌的生化鉴定结果完全一致，三者无法区分。而且各别菌种尤其是商业化菌种的生化反应鉴定结果受到其自身条件的影响，易出现假阳性或假阴性结果等等。此时采用分子生物学鉴定技术对乳杆菌菌种进行鉴定显得尤为迫切。

本研究采用16S rDNA扩增序列比对分析、16S rDNA限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术和种特异性序列扩增3种分子生物学鉴定手段，针对以上提到的部分菌种同时也是检测工作时样品中常见的4种乳杆菌：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及与后两者无法区分的干酪乳杆菌Lactobacillus casei进行鉴定分析，建立了分子生物学鉴定方法，以弥补标准中传统生化鉴定的不足。

2　材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

干酪乳杆菌干酪亚种（CICC6117）、嗜酸乳杆菌（CICC6074）、鼠李糖乳杆菌（CICC7469）、植物乳杆菌（CICC6073=299v）、动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis（CICC6165）：均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；植物乳杆菌（GIM1.140）：购自北京陆桥技术有限责任公司；副干酪乳杆菌：来自检测样品。

2.1.2试剂

MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基：均购自北京陆桥技术有限责任公司；各种引物：由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；限制性内切酶（AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ）：NEB（北京）有限公司；基因组DNA提取试剂盒、溶菌酶、蛋白酶K：天根生化科技（北京）有限公司；taq DNA酶、dNTP、10×PCR buffer、6× Loading buffer、DL2000 Marker：大连宝生物TAKARA有限公司；gel-red荧光核酸凝胶染色试剂：Biotium；琼脂糖：英潍捷基（上海）贸易有限公司；化学试剂：均为分析纯，西陇化工股份有限公司。

2.2方法

2.2.1乳杆菌的培养及DNA提取

6株乳杆菌菌种悬液涂布于MRS琼脂培养基平板，36℃培养48 h-72 h；从平板上挑取单菌落至MRS肉汤中，36℃培养18 h-24 h，按基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。

2.2.2乳杆菌的16S rDNA序列分析

将提取的6株乳杆菌DNA进行PCR扩增，采用16S通用引物[15]，正向引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；2%琼脂糖凝胶凝胶电泳，目的片段长度约1500 bp，产物纯化后送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序；将所得基因序列测序结果登陆GenBank数据库进行BLAST比对，采用DNAstar（lasergene）软件分析序列相似性；再采用MAGA5.0软件通过邻接法（Neighbor-Joining）构建的系统发育树判断乳酸菌的同源关系。

2.2.3乳杆菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

4株乳杆菌（嗜酸乳杆菌CICC6074、鼠李糖乳杆菌CICC7469、植物乳杆菌CICC6073=299v、副干酪乳杆菌）的16S rDNA扩增产物分别用AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ进行酶切[16]，酶切产物用2%琼脂糖凝胶凝胶电泳。

2.2.4种特异性PCR[17，18]

使用干酪乳杆菌种特异性引物（正向引物L. casei：5'-TGC ACT GAG ATT CGA CTT AA-3'，反向引物Y2：5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'）、副干酪乳杆菌种特异性引物（正向引物L.para：5'-CAC CGA GAT TCA ACA TGG-3'，反向引物Y2）、鼠李糖乳杆菌种特异性引物（正向引物L.rham：5'-TGCATCTTGATTTAATTTTG-3'，反向引物Y2），对干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌进行种特异性扩增。2%琼脂糖凝胶凝胶电泳，目的片段长度约290 bp。

3　结果与分析

3.1乳杆菌的16S rDNA序列同源性分析

5株乳杆菌的16S rDNA扩增产物序列与GenBank数据库中给出的标准菌株16S rDNA进行比对，采用DNAstar（lasergene）软件统计各序列相似度：副干酪乳杆菌（NO.1）、干酪乳杆菌（NO.4）的相似度为99.3%，鼠李糖乳杆菌（NO.7）与前两者的相似度分别为98.9%和99.1%，3者与GenBank数据库中标准菌株的相似度都在99%以上；嗜酸乳杆菌（CICC6074）与GenBank数据库中标准菌株的相似度在99%以上；植物乳杆菌（CICC6073=299v）、植物乳杆菌（GIM1.140）与GenBank数据库中标准菌株的相似度都在99%以上；嗜酸乳杆菌和2株植物乳杆菌与副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌3者的相似度在93%以下。结果详见图1。

通过MEGA5.0软件邻接法（Neighbor-Joining）构建的系统进化树，结果见图2。

以非同属的动物双歧杆菌（CICC6165）为外标，副干酪乳杆菌（NO.1）、干酪乳杆菌（NO.4）、鼠李糖乳杆菌（NO.7）所属分支接近，2株植物乳杆菌（CICC6073=299v、GIM1.140）、嗜酸乳杆菌（CICC6074）分属于不同的分支，且与对应标准菌同支。该结果与比对结果一致。

图1　乳杆菌16S rDNA序列比对相似度结果

图2　基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法构建的系统发育树

3.2乳杆菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

4株乳杆菌16S rDNA PCR扩增产物经AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ内切酶酶切得到不同长度的片段，通过分析片段谱图可以在一定程度上将4种菌进行区分。乳杆菌16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱见图3。

图3显示，泳道1-4、5-8、9-12依次为副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌（CICC6073=299v）的AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ内切酶谱图。嗜酸乳杆菌的3种酶切谱图（泳道3/7/11）与其他3种菌都不相同；副干酪乳杆菌（泳道5）HinfⅠ酶切谱图与鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌谱图（泳道6/8）不相同；植物乳杆菌的AluⅠ酶切谱图（泳道4）与副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌谱图（泳道1/2）不同，其HaeⅢ酶切谱图（泳道12）也与副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌谱图（泳道9/10）略有不同。将以上结果归纳于表1中。

图3　乳杆菌16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱

表1　乳杆菌16S rDNA PCR-RFLP分析结果

3.3种特异性PCR扩增

乳杆菌16S rDNA序列同源性分析显示，干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌相似度很高，这与文献[13，15]报道一致。在菌种未知的情况下，采用16S rDNA同源性分析很难有效将3者区分，此时可通过种特异性PCR对3者进行鉴别。干酪乳酸菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌种特异性扩增图谱见图4。

图4　干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌种特异性扩增图谱

图4所示，泳道1-4、5-8、9-12依次为干酪乳杆菌特异性、副干酪乳杆菌特异性、鼠李糖乳杆菌特异性扩增谱图。在干酪乳杆菌特异性扩增中（泳道1-4，依次为干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、空白对照），只有干酪乳杆菌出现单一目的条带（290 bp）；在副干酪乳杆菌特异性扩增中（泳道5-8，菌种顺序同泳道1-4），只有副干酪乳杆菌出现单一目的条带（290 bp）；在鼠李糖乳杆菌特异性扩增中（泳道9-12，菌种顺序同泳道1-4），只有鼠李糖乳杆菌出现单一目的条带（290 bp）。总结扩增结果，通过3种乳杆菌的特异性引物扩增，可有效将这3种菌区分开，见表2。

表2　干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌特异性扩增结果

4　讨论

16S rDNA扩增同源性分析可进行种水平或亚种水平的乳杆菌鉴定，能够区分嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等，其种间相似度低于93%。但对于亲缘关系极近的乳杆菌（16S rDNA序列相似度达99%以上），如鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌，则无法采用该方法鉴别。16S rDNA PCR-RFLP技术可以有效鉴定嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌，而干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的酶切带型完全一致而无法区分（在本文中未体现）。鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌3者则可采用种特异性序列扩增进行有效鉴别。

除本研究采用的3种方法外，还有随机扩增DNA多态性分析（RAPD）[16]、扩增片段长度多态技术（AFLP）、变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）[17，18]、16S-23S rRNA区间序列分析等多种技术也可用于乳杆菌的鉴定。鉴于乳杆菌的多样性特点和每一种分子技术的局限性，目前还无法通过单纯一种分子鉴定手段完成所有乳杆菌的鉴定工作。本研究采用的3种技术是众多技术中对人员、仪器、耗材要求较低的几种，更适于广大检测机构的实际应用。实验人员在检验工作中以传统生化鉴定为基础，结合以上一种或几种分子生物学方法，可对难以用生化鉴定法确认的乳杆菌进行有效地鉴别。

5　结论

本研究通过16S rDNA扩增同源性分析、16S rDNA PCR-RFLP技术和种特异性序列扩增技术的综合分析，有效完成了副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的鉴定工作。希望本研究方法能应用于更多乳杆菌的鉴定，并在此基础上，优化筛选更适合的分子鉴定方法，以用于乳杆菌及其他乳酸菌的分型鉴定，使食品中乳杆菌分型鉴定工作得到普及，推动整体微生物检测水平的发展，为进一步完善食品中乳杆菌检测标准提供技术支持。

[1]中华人民共和国卫生计生委.关于发酵乳杆菌CECT5716等3个菌种的公告[A].2016年第6号公告.

[2]中华人民共和国卫生计生委.关于批准塔格糖等6中新食品原料的公告[A].2014年第10号公告.

[3]中华人民共和国卫生计生委.关于批准壳寡糖等6种新食品原料的公告[A].2014年第6号公告.

[4]中华人民共和国卫生部.关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告[A].2011年第25号公告.

[5]中华人民共和国卫生部.关于批准翅果油等2种新资源食品的公告[A].2011年第1号公告.

[6]中华人民共和国卫生部.关于批准γ-氨基丁酸、初乳碱性蛋白、共轭亚油酸。共轭亚油酸甘油脂、植物乳杆菌（菌株号ST-Ⅲ）、杜仲籽油为新资源食品的公告[A].2009年第12号公告.

[7]中华人民共和国卫生部.关于批准低聚半乳糖等新资源食品的公告[A].2008年第20号公告.

[8]中华人民共和国卫生部.关于批准嗜酸乳杆菌等7种新资源食品的公告[A].2008年第12号公告.

[9]中华人民共和国卫生部监督局.关于已获批准新资源食品调查情况的函[A].卫监督食一便函〔2008〕140号，中华人民共和国卫生部卫新食准字（2007）第0006号.

[10]SNT 1941.3-2007进出口食品中乳酸菌检验方法第3部分：乳酸杆菌的PCR法[S].

[11]GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验[S].

[12]李佳，李艳，牟德华.16S rDNA PCR-RFLP分析鉴定开菲尔发酵剂中的乳酸菌[J].食品科学，2015，36（7）：158-161.

[13]于洁，孙志宏，张家超，等.16S rDNA-RFLP技术鉴定西藏地区乳制品中的乳杆菌[J].食品与生物技术学报，2009，38（6）：804-810.

[14]WARD L J H，TIMMINS M J.Differentiation of Lactobacillus casei，Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction[J].Letters in Applied Microbiology，1999，29（2）：90-92.

[15]夏雪娟，陈芝兰，陈宗道，等.16S rDNA序列分析法快速鉴定西藏地区传统乳制品中的乳酸菌[J].食品科学，2013，34（14）：245-249.

[16]Terzic'-Vidojevic' A，Tonkovic' K，Pavunc A L，et al.Evaluation of autochthonous lactic acid bacteria as starter cultures for production of white pickled and fresh soft cheeses[J].LWTFood Science and Technology，2015，63（1）：298-306.

[17]LIU WENJUN，BAO QIUHUA.Isolation and identification of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of Chinaby16SrRNAsequencesandDGGEanalysis[J]. Microbiol Res，2012，167：110-115.

[18]包秋华，王俊国，刘文俊，等.传统发酵乳制品曲拉中乳酸菌多样性分析[J].中国乳品工业，2016，44（7）：12-19.

Identification of Lactobacillus of New Resource Food by Molecular Biology Methods

XUE Xiaojing，ZHANG Yanxin，CHEN Huijun，MA Jie，WANG Fang，LU Yun
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100123）

Identification of four species（L.paracasei，L.rhamnosus，L.plantarum，L.acidophilus）of Lactobacillus of new resource food by using techniques of the analysis of 16S rDNA homology amplification，16S rDNA PCR-RFLP and species-specific sequence amplification.The results show that the analysis of 16S rDNA homology amplification can identify L.plantarum and L.acidophilus effectively，but it is not useful to distinguish between L.paracasei and L.rhamnosus.16S rDNA PCR-RFLP technique identify L.paracasei，L. rhamnosus，L.plantarum，L.acidophilus effectively.Species-specific amplification can effectively identify L. paracasei and L.rhamnosus.Considering the requirements of examination，the above methods can be used to identify the strains which can not be identified by the biochemical identification method described in the national standard of food safety.

New Resource Food；Identification of Lactobacillus；16S rDNA；RFLP；Species-Specific Amplification

R939.11+7

E-mail：xuexiaojing@caiqtest.com

中国检验检疫科学研究院科研项目（2015JK019）

2016-09-23