鲤鱼浮肿病流行情况的初步研究

徐立蒲　王静波　张文　潘勇　曹欢　王姝　王小亮　王澎　那立海　江育林

（1.北京市水产技术推广站　北京　100021；2.中国检验检疫科学研究院）

鲤鱼浮肿病流行情况的初步研究

徐立蒲1王静波1张文1潘勇1曹欢1王姝1王小亮1王澎1那立海1江育林2*

（1.北京市水产技术推广站北京100021；2.中国检验检疫科学研究院）

为了明确北京顺义某锦鲤养殖场患病锦鲤的发病死亡原因，根据鲤鱼浮肿病毒基因的保守序列设计引物进行套式PCR扩增，产物经电泳后可见548 bp片段和180 bp片段的DNA条带，空白对照无扩增条带；套式PCR的产物进行测序，测序结果和Genbank公布的鲤鱼浮肿病毒H504株序列完全一致。结果显示这是由鲤鱼浮肿病毒引起的鲤鱼浮肿病，并通过进一步分析，提示鲤鱼浮肿病在北京地区已经有所扩散，应引起养殖者以及鱼病工作者的关注。

鲤鱼浮肿病；鲤鱼浮肿病毒；锦鲤疱疹病毒病；锦鲤；鲤

1　前言

锦鲤疱疹病毒病（Koi herpes virus disease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus，KHV）引起、危害鲤和锦鲤的常见和最重要的病毒病之一。KHV主要感染各规格鲤和锦鲤，临床症状主要是烂鳃、眼凹陷、皮肤损害等[1]，感染后死亡率在90%以上。近年来，在北京养殖的鲤和锦鲤中出现了一种具有烂鳃、眼凹陷等类似KHVD临床特征的疾病，用检测KHV的PCR方法多次检测，结果均为KHV阴性，引起猜测。2016年5月下旬，北京市顺义区某锦鲤养殖场发病，病鱼出现烂鳃、凹眼瞪，但KHV检测结果依然为阴性。但用鲤鱼浮肿病毒（Carp Edema Virus，CEV）进行PCR扩增，并且测序结果和Genbank公布的结果进行比较，结果显示发病锦鲤是由CEV感染引起。

鲤鱼浮肿病（Koi sleepy disease，KSD）是在国际上流行的外来病，其病原是CEV，在我国尚未见报道。本研究结果提示CEV已经进入我国，并对鲤和锦鲤养殖业造成了威胁。现将研究报告如下，以为开展进一步的监测、防控工作提供基础资料。

2　材料与方法

2.1材料

2.1.1病料来源

北京市顺义区某锦鲤养殖场的患病锦鲤。

2.1.2试剂

DNA抽提试剂盒：德国QIAGEN公司；引物合成及测序：由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；PCR扩增试剂：北京百泰克公司。

2.1.3仪器

台式冷冻离心机：德国艾本德公司，Centrifuge 5418R；梯度PCR仪：美国AB公司，ABI veriti；电泳仪：北京六一仪器公司，DYY-6C；凝胶成像系统：北京赛智公司，ChampGel-5000；显微镜：奥林帕斯，CX-41。

2.2方法

2.2.1鳃丝显微镜观察

制作病鱼鳃丝水浸片，在1000倍显微镜下观察鳃丝。

2.2.2分子生物学检测

取病鱼鳃、肾、肝、脑、脾，混合后研磨匀浆，制成样1、样2，4℃过夜；用DNA抽提试剂盒抽提核酸，做套式PCR扩增，引物根据已知CEV基因的保守序列设计[2]；第一次PCR扩增的正向引物F1：5'-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3'，反向引物R1：5'-TGCAGGTTGCTCCTAATCCT-3'，扩增该基因中的548片段；第二次扩增的正向引物F2：5'-GCTGCTGCACTTTTAGGAGG-3'，反向引物R2：5'-TGCAAGTTATTTCGATGCCA-3'，再从中扩增180片段。反应条件为：94℃5 min，94℃2 min，60℃1 min，72℃1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。将嵌套PCR后的产物纯化后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析。

另外还使用扩增KHV的TK和SPH基因的引物对该样品做PCR扩增[3]。

3　结果

3.1发病鱼池情况

5月20日，该养殖场有2个鱼池发病；到6月1日，鱼死亡情况基本停止。1号池有鱼2000 kg，死亡约1000 kg，10 d累计死亡率为50%；2号池有鱼5000 kg，死亡约500 kg，10 d累计死亡率为10%。据调查，1号池在发病前水颜色异常，呈土色；2号鱼池水色正常。该场在发病前2天对1、2号池均采用了投放芽孢杆菌、富藻素等产品，并将其他鱼池水加注到这2个鱼池，结果2日后2个鱼池均出现发病死亡情况。发病后，该场还向池中泼洒氟苯尼考以及大黄，结果出现更多鱼死亡。

3.2临床症状

发病水温23℃，患病锦鲤全长10-15 cm，体重约100 g，有烂鳃、凹眼症状（图1），解剖可见各内脏形态基本正常。其临床症状类似KHV感染。

图1　发病锦鲤

3.3鳃丝显微镜观察

在1000倍显微镜下可见鳃丝上有大量杆状细菌，类似柱状黄杆菌（图2）。

图2　显微镜下可见细长杆菌（×1000）

3.4病毒的分子生物学特性

病鱼的鳃、肾、肝、脑、脾组织抽提核酸后，根据CEV基因的保守序列设计引物进行套式PCR扩增，产物经电泳后可见548 bp片段和180 bp片段的DNA条带，空白对照无扩增条带（图3）。套式PCR的产物进行测序，其测序结果在NCBI上进行比对，与已报道的CEV序列（GeneBank ID：KM283182，分离株：H504）同源性达到100%（图4）。

图3　CEV经PCR（a）和套式PCR（b）后的产物

图4　该病毒和CEV H504株的部分基因片段的序列比较结果

同时用特异性扩增KHV的TK和SPH基因的引物，对该样品进行PCR扩增，没有见到有相应的DNA扩增片段。

以上结果表明，此养殖场的患病锦鲤是被CEV感染而非KHV；鳃丝上的细长杆菌推测是继发感染柱状黄杆菌。

4　讨论

KSD最早发生于日本新泻[4]，近年在德国、法国、英国、荷兰、捷克、奥地利、土耳其等国发现养殖鲤和锦鲤因CEV感染引起爆发性死亡的情况[5，6]，成鱼和幼鱼均会发病，具昏睡、鳃损害、凹眼、皮肤损害等症状，这些临床症状与KHVD类似。由于KSD仅在国外报道，暂时还未能引起国内同行的足够重视。

KHVD在国内已经被多次检出，并对渔业生产造成严重危害。过去，每当鲤和锦鲤在水温20℃-30℃发生大量死亡时，如果出现烂鳃、眼凹陷、皮肤损害等临床症状，通常就初步判断由KHV引起，用PCR也很容易确诊。然而，近年来在北京以及全国各地养殖的鲤和锦鲤中多次出现一种高死亡率的鱼病，发病鱼也有烂鳃、凹眼等类似KHVD的临床特征，但实验室多次用PCR检测结果显示为KHV阴性。2014年7月和8月，北京房山区2个养殖场各种规格锦鲤发病死亡，发病鱼呈烂鳃、凹眼，死亡率高达80%以上，后经检测确定是CEV感染引起。而这次在北京顺义的养殖场又一次检测到CEV，提示该病毒已经在北京地区扩散。

KHVD和KSD这两种病症状很类似，但发病温度略有差别。前者在20℃-30℃之间[1]；而后者发病水温范围较广，据报道在7℃-28℃都有发病[2，4-6]，本次发病水温23℃。因此当水温在20℃以上，鲤或锦鲤出现烂鳃、凹眼等症状，并导致高死亡率时，难以再依靠临床特征区分两种病，而需要通过PCR检测来确证。此外本次在发病鱼鳃丝上还可见大量细长杆菌，推测是柱状黄杆菌，该菌也可引起烂鳃症状。这给现场单纯依靠临床症状初步诊断KHVD或KSD带来较大困难，需要进一步研究上述疾病在临床上表现出的不同症状特点。

此次发生KSD是在鱼池进行水质调节后，并且死亡率较高的1号池水色呈土色，明显水质恶化；死亡率较低的2号池水质明显好于1号池。推测KSD的发生及造成的死亡率与养殖环境有关。

进一步回顾本实验室近年的鱼病监测工作，2014年7月，北京市怀柔区某水库网箱养殖的大规格鲤发病，死亡率90%，病鱼出现烂鳃、凹眼等症状，未能检测到KHV；同年9月，河北省唐山市曹妃甸2个养殖场的鲤大面积死亡，出现烂鳃、凹眼等症状，均未能检测到KHV。可见在2年前就出现过类似KHVD的临床症状但检测又是PCR阴性的情况，提示CEV可能2年前就已经进入我国并在各地流行。

5　结论

CEV可感染锦鲤并导致发病死亡，经分析该病已经在北京地区扩散，并可能已经扩散到我国各鲤和锦鲤养殖区。由于CEV和KHV感染引起的症状类似，都能够引起养殖鲤和锦鲤的高死亡率，临床上难以区分。因此有必要引起养殖者以及鱼病工作者重视，对KSD进行普查和流行病学监测。

[1]陈爱平，江育林，钱冬，等.锦鲤疱疹病毒病[J].中国水产，2010，10：58-59.

[2]親松剛，的山央人，山本健也，等。PCR法にょゐコィ浮腫症ゥィルズ検出の試み[J].水产增殖，1997，45（2）：247-251.

[3]SC/T7212.1-2011，鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒[S].

[4]Shin-ichi Ono，Akira NAGAI，Noriaki SUGAI.A Histopathological Study on Juvenile Colorcarp，Cyprinus carpio，Showing Edema[J].Fish Pathology，1986，21（3）：167-175.

[5]Verena Jung-Schroers，Mikolaj Ademek，Felix Teitge，et al.Another potential carp killer?：Carp Edema Virus disease in Germany [J].BMC Veterinary Research，2015，11：114-117.

[6]E Lewisch，B Gorgoglione，K Way，et al.Carp Edenma virus/Kio sleepy disease：An Emerging Disease in Central-East Europe[J]. Transboundary and Emerging Disease，2014，9：1-7.

A Preliminary Study of Carp Edema Virus Disease

XU Lipu1，WANG Jingbo1，ZHANG Wen1，PAN Yong1，CAO Huan1，WANG Shu1，WANG Xiaoliang1，WANG Peng1，NA Lihai1，JIANG Yulin2*
（1.Beijing Aquaculture Technology Extention Station，Beijing，100021；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

To find the potential reason causing Koi to die in a fishing farm in Shunyi district，Beijing，the nested PCR was performed with the degenerate primers.After gel electrophoresis，two bands，548 bp and 180 bp，were obtained in samples from the dead fish and no band was found in samples from the health fish.Then，these bands were sequenced and the sequences were blasted to CEV H504 sequence in NCBI database.The result showed that the CEV causes the Koi to die.And the present results implied that the CEV has spread in Beijing area，and more attention should be paid to reduce the loss of fishing income.

Koi Sleepy Disease；Carp Edema Virus；Koi Herpes Virus Disease；Koi；Carp

Q789

E-mail：xulipu001@163.com；*通信作者E-mail：yulinjiangpost@gmail.com

北京市农业试验示范项目（20160117）；现代农业产业技术体系北京市观赏鱼创新团队（GSY-02-09）

2016-06-13