加速溶剂萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定沉积物中三苯甲烷类杀菌剂

张蓓蓓,赵永刚

(江苏省环境监测中心，国家环境保护地表水环境有机污染物监测分析重点实验室，江苏 南京 210036)



加速溶剂萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定沉积物中三苯甲烷类杀菌剂

张蓓蓓*,赵永刚

(江苏省环境监测中心，国家环境保护地表水环境有机污染物监测分析重点实验室，江苏 南京 210036)

采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)，结合加速溶剂萃取(ASE)前处理技术，建立了同时测定沉积物中3种三苯甲烷类残留(孔雀石绿、结晶紫、亮绿)的方法。干燥研磨后的底泥样品用中性氧化铝混合分散，以乙腈-McIlvaine缓冲溶液(体积比10∶2)为萃取液，经ASE萃取富集后进入液相色谱-串联质谱分析，内标法定量。结果表明：3种三苯甲烷类化合物的峰形对称并完全分离，在0.5～50.0 μg/L范围内线性良好(r>0.998)；在1 500 psi压力及60 ℃萃取温度下，目标物的回收率为65.8%～112%，相对标准偏差(n=6)为5.1%～14.4%，方法检出限为0.006～0.007 μg/kg，定量下限为0.024 ～0.028 μg/kg。该方法已用于滆湖沉积物中3种目标化合物的检测，为我国环境监管提供了技术支撑和数据支持。

三苯甲烷类；超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)；加速溶剂萃取(ASE)；沉积物

孔雀石绿(Malachite green，MG)、结晶紫(Crystal violet，CV)和亮绿(Brilliant green，BG)均为三苯甲烷类染料，最初用于纺织工艺中，后因其具有消毒性和杀菌性而广泛地用于水产品的养殖过程，作为鱼病防治的杀菌剂和抗寄生虫药，在运输过程中也用作消毒剂，延长鱼的存活时间。该类物质被鱼类吸收后，大部分会快速地转化为隐色孔雀石绿(Leucomalachite green，LMG)和隐色结晶紫(Latent crystal violet，LCV)。由于这些代谢物具有很好的亲脂性，因而在鱼类的脂肪组织中会形成稳定的残留，长期存在于生物体内[1-2]。研究表明，70%以上的饲料中添加的渔业养殖用药都沉积于底栖环境，从而半衰期延长，危害加大[3]。三苯甲烷类作为工业染料而产生的废水可能进入地表水。而这类染料吸附性强，更易吸附于沉积物中[4-6]。由于这类物质具有致癌、致畸和致突变作用，因此，包括欧美、中国在内的国家均将孔雀石绿和结晶紫列为水产养殖禁用药物。但我国目前对水环境中这类杀菌剂并无相关控制限值，存在环境监管盲点。

目前，国内外文献报道有关三苯甲烷类物质的测定多采用液相色谱法(紫外检测、荧光检测)[7-10]或液相色谱-质谱联用技术[11-19]，且多集中于水产品及水体中MG和CV的检测，对沉积物介质的研究较少。文献[12-14]均采用超声萃取法对沉积物中的三苯甲烷类化合物进行提取，且主要集中在孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物上，对亮绿的研究很少。本文首次采用加速溶剂萃取技术，对3种目标物的同时萃取进行了细致优化，获得了较好的提取回收率。建立了加速溶剂萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定沉积物中MG,CV和BG的分析方法，并首次报道了滆湖沉积物中三苯甲烷类化合物的污染状况，为环境监管提供了一定的技术支撑和数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器设备

ACQUITY UPLC超高效液相色谱(美国Waters公司)；AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪(美国 AB公司)；加速溶剂萃取仪(Dionex ASE200)；真空冷冻干燥机(美国Labconco公司)，氮吹浓缩仪(美国Zymark公司)；0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜针头式过滤器、Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)；涡旋混合器(日本LMS公司)。

1.2 试剂与试剂配制

标准品:孔雀石绿(纯度98.0%)、结晶紫(纯度92.5%)、亮绿(纯度96.0%)、氘代结晶紫(CV-D6，纯度99.0%)均为德国Dr.Ehrenstorfer公司试剂；氘代孔雀石绿(MG-D5，纯度99.7%)为德国Witega公司试剂。 乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵(色谱纯，德国 Merck公司)；盐酸羟胺、对甲苯磺酸(纯度>99%，瑞士Adamas公司)；磷酸氢二钠、柠檬酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为Millipore超纯水(TOC<1 ppb)。

标准及内标储备液(1 000 mg/L)配制：准确称取(10±0.1) mg的MG，CV，BG标准品及MG-D5，CV-D6内标物，用乙腈溶解后定容于10 mL容量瓶中，配制1 000 mg/L的储备液。以上标准溶液避光保存于4 ℃冰箱中，临用前稀释成适当浓度的标准工作溶液。

McIlvaine缓冲溶液(pH 3.0)：由0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液18.9 mL和0.1 mol/L柠檬酸溶液81.1 mL混合配制。

1.3 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式。离子化电压(IS)：5 000 V，离子源温度(TEM)：600 ℃，气帘气(CUR)：40 psi，喷雾气(GS1)：55 psi，辅助加热气(GS2)：60 psi，碰撞气(CAD)：High，驻留时间20 ms。各物质离子对优化后的参数见表1。

表1 目标化合物的多离子反应监测参数

* quantitative ion

1.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司)。流动相：5 mmol/L乙酸铵水溶液(甲酸调至pH 4.5)(A)和乙腈(B)；采用梯度洗脱模式：0 min，20% B，保持0.5 min；0.5～2.9 min时，线性增至80%B，保持1 min；4 min后恢复为20% B，平衡1 min结束。流速0.5 mL/min，进样体积10 μL；柱温：50 ℃；内标法定量。

1.5 样品处理

用不锈钢抓斗式采泥器在滆湖采集13个表层沉积物样品(0～20 cm)，每个样点采集不低于1 kg的泥样，样品采集后放入干净的250 mL棕色玻璃瓶中加盖密封，立即运回实验室于-20 ℃下保存至分析。

沉积物样品冷冻干燥磨细后过40目筛，准确称量(5.0±0.05) g，与25 g中性氧化铝搅拌混匀置于ASE萃取池中，加入1 mL 10%盐酸羟胺溶液、1 mL 1.0 mol/L对甲苯磺酸溶液，将萃取池置于加速溶剂萃取仪中。萃取溶剂：乙腈-McIlvaine缓冲溶液(10∶2)；压力：1 500 psi；温度：60 ℃；时间：5 min；循环次数：2次。萃取液经无水硫酸钠除水后，转移至氮吹管中，用氮吹浓缩仪吹至近干，用乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(甲酸调至pH 4.5)溶液(2∶8)定容至1.0 mL，加入10 μL内标混合溶液(1 000 μg/L)，涡旋振荡混匀，过0.22 μm PVDF滤膜，置于进样瓶中，采用UPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

在ESI+/-及APCI+/-4种方式下，对浓度为200 μg/L的3种三苯甲烷类化合物单标溶液进行一级质谱母离子扫描，结果表明在ESI正离子模式下3种目标物均有较好的响应，基峰为[M+H]+，这与3种目标物的分子极性较大且均具有铵离子基团的结构性质相符。选定[M+H]+为母离子，进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片并优化相应的碰撞能量，三苯甲烷类物质的二级碎片质谱图见图1。

图1 3种三苯甲烷类物质的二级碎片离子质谱图

2.2 加速溶剂萃取条件的优化

针对本实验，由于空白底泥样品不易得到，因此在条件优化实验中最终选择中性氧化铝粉末作为模拟空白底泥样品，中性氧化铝粉末中均不含3种目标物。配制3种目标物加标浓度为5.0 μg/kg的模拟加标样，用于以下实验条件的优化。

2.2.1 分散剂的选择 加速溶剂萃取时，需在萃取池中填充分散剂，以使样品分散，并与萃取溶剂更好地接触，且分散剂应尽量避免对所测目标化合物产生吸附。本实验分别选择硅藻土、石英砂、中性氧化铝作分散剂，在萃取压力1 500 psi、萃取温度60 ℃条件下，以乙腈-McIlvaine缓冲溶液(10∶2)作为萃取剂，考察了分散剂对目标物的吸附情况。结果表明，选用中性氧化铝作为分散剂时，对沉积物中3种目标物的吸附最少，萃取回收率最高。

2.2.2 萃取溶剂的选择 在萃取压力1 500 psi、萃取温度60 ℃条件下，以中性氧化铝为分散剂，比较了丙酮-甲醇(1∶1)、丙酮-乙腈(1∶1)、二氯甲烷-乙腈(1∶1)和乙腈-McIlvaine缓冲溶液(10∶2)对底泥样品中目标物的萃取情况。结果表明，以乙腈-McIlvaine缓冲溶液(10∶2)为萃取溶剂时，MG，CV和BG的萃取效率最高，其回收率分别为98.0%，74.9%和82.6%。

2.2.3 萃取温度及萃取压力的优化 在加速溶剂萃取过程中，萃取温度对目标物的回收率也会产生影响。本实验选定萃取溶剂及分散剂后，在萃取压力为1 000 psi的条件下，选择不同的萃取温度(40，50，60，70 ℃)进行比较，结果表明萃取温度在60 ℃时3种目标物的回收率最好。

进一步对不同萃取压力(500，1 000，1 500，2 000 psi)进行优化，结果表明在1 500 psi压力条件下，3种目标物的萃取效率略优。

2.3 标准曲线、检出限与定量下限

在上述优化条件下，配制浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的标准系列使用液1.0 mL，分别加入10 μL混合内标液(1 000 μg/L)，混匀。以待测物与内标物定量离子的峰面积比(Y)对待测物的质量浓度(X，μg/L)进行线性回归。结果显示，3种目标物在0.5～50.0 μg/L质量浓度范围内与相应峰面积呈良好的线性关系，相关系数(r)大于0.998。

根据HJ168-2010方法检出限测定要求，配制浓度为0.05 μg/kg的5 g中性氧化铝加标样7份。按照样品分析过程进行测定，计算7次平行测定的标准偏差S，以3S为方法检出限(MDL)，4倍MDL为定量下限(LOQ)。结果表明，MG,CV,BG的MDL分别为0.007，0.006，0.007 μg/kg，LOQ分别为0.028，0.024，0.028 μg/kg。该方法具有较高的灵敏度，完全满足底泥中三苯甲烷类物质的分析测定要求。

2.4 精密度与回收率

配制低(0.5 μg/kg)、中(5.0 μg/kg)、高(10.0 μg/kg) 3个浓度水平的沉积物加标样各6份，按上述优化实验条件进行准确度和精密度实验。选取的沉积物样品在加标前进行测定。每个添加浓度平行测定6份样品，计算加标回收率和相对标准偏差(表2)。结果表明：3种目标物的回收率为65.8%～112%，相对标准偏差(RSD)为5.1%～14.4%。方法的准确度和精密度均符合痕量分析的要求。

表2 沉积物中3种目标物的回收率及精密度(n=6)

2.5 实际样品分析

应用建立的分析方法，对滆湖13个点位的沉积物样品进行分析，3种目标物的检出率均为100%，其中MG的检出量为0.304～9.54 μg/kg，CV的检出量为0.619～6.70 μg/kg，BG的检出量为0.059～1.31 μg/kg。实际底泥样品的多反应监测色谱图见图2。3种目标物在滆湖沉积物中的普遍检出，可能与滆湖发达的水产养殖业相关。目前，国内违规使用孔雀石绿和结晶紫的现象已得到较好控制，但由于其价格低和效果显著等优点，仍有少数渔民在非法使用，再加上曾经被广泛应用，导致部分养殖环境表层底泥已蓄积了此类杀菌剂，且不断向水体缓慢释放，成为其二次污染的主要来源，该现象应当引起环境监管部门的重视。

3 结 论

本文建立了ASE/UPLC-ESI/MS/MS同时分析沉积物中三苯甲烷类杀菌剂的方法，实际样品的测定表明，方法具有灵敏、准确、重现性好的特点，完全满足环境样品的监测要求。

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Simultaneous Determination of Three Triphenylmethane Bactericides in Sediment by Accelerated Solvent Extraction and Ultra-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Bei-bei*,ZHAO Yong-gang

(State Environmental Protection Key Laboratory of Monitoring and Analysis for Organic Pollutants in Surface water,Environment Monitoring Center of Jiangsu Province,Nanjing 210036,China)

An ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the analysis of three triphenylmethane bactericides in sediment by accelerated solvent extraction(ASE).The analytes were extracted from the dispersed samples with neutral alumina by ASE using acetonitrile-McIlvaine buffer(10∶2，by volume) as solution.The extract were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode,quantified by the internal standardization.The calibration curves of three triphenylmethane dyes were linear in the range of 0.5-50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.998.Under the optimal extraction conditions of 60 ℃ temperature and 1 500 psi pressure,the recoveries of three compounds ranged from 65.8% to 112%,with RSDs(n=6) of 5.1%-14.4%.The limits of detection and quantitation were in the range of 0.006-0.007 μg/kg and 0.024-0.028 μg/kg,respectively.The method was successfully used to detect the sediment samples from Gehu Lake.

triphenylmethane;ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);accelerated solvent extraction(ASE);sediment

2016-04-06；

2016-05-05

江苏省环境监测基金项目(1305)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.019

O657.63;S482.2

A

1004-4957(2016)10-1328-05

*通讯作者：张蓓蓓，硕士，高级工程师，研究方向：环境中有毒有害污染物监测，Tel：025-86575235，E-mail：oviliacpu2003@yahoo.com.cn