微波辅助提取/液相色谱-串联质谱法同时测定人体指甲中14种抗精神失常及安眠镇静类物质

冯雪伊,陈 航,沈 敏*,向 平

(1.中国刑事警察学院 法化学系，辽宁 沈阳 110854;2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063)



微波辅助提取/液相色谱-串联质谱法同时测定人体指甲中14种抗精神失常及安眠镇静类物质

冯雪伊1,2,陈 航2,沈 敏2*,向 平2

(1.中国刑事警察学院 法化学系，辽宁 沈阳 110854;2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海 200063)

采用微波辅助提取(MAE)与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，建立了同时测定人体指甲中14种抗精神失常及安眠镇静类物质的分析方法。指甲经冷冻研磨后加入内标溶液，用微波辅助提取。以Allure PFPP苯基柱分离，甲醇(含20 mmol/L乙酸铵)-乙酸铵(20 mmol/L)进行梯度洗脱，采用二级质谱多反应监测模式(MRM)检测14种抗精神失常和安眠镇静类物质及其代谢物。目标物在对应含量范围内均线性良好(r2≥0.990)；检出限为0.1～50 pg/mg；大多数目标物的定量下限为100 pg/mg；日内精密度和日间精密度均不大于7.8%；准确度在±10.16%范围内。对7例服用部分抗精神失常及安眠镇静类药物的患者指甲进行分析，目标物检出情况与用药情况相符。该方法样品处理简便、高效、快速且分析准确、灵敏度高、选择性好，可用于人体指甲中pg/mg级抗精神失常及安眠镇静类物质的定性定量分析。

微波辅助提取(MAE)；液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；指甲；抗精神失常及安眠镇静类物质

新型生物样品(Alternative specimens)开发是目前国际法庭科学界的研究焦点[1]，其中指甲具有取材方便无创、样品安全清洁、便于保存运输、检测窗口时限长、待测目标物稳定、能反映较长摄药史等优点[2]，具有极高的证据价值。在临床药理研究等领域，指甲的分析潜力正逐步被挖掘(如体内治疗药物监测、宫内药物暴露分析等)，尤其在法庭科学领域中，指甲样品是涉毒、涉药案件的新兴检材和研究热点[3]。本课题组借助丰富的生物样品分析经验和广泛的案源基础，在之前的研究中建立了指甲中单个抗精神失常及安眠镇静类物质的多种分析方法[4-6]；并通过与其他传统生物样品的对比分析证明了指甲样品的优势[5,7]，同时对药物进入指甲的机理进行了初探[8]。上述研究成果引起了国际法庭科学界学者与专家的关注[4,9-11]。为进一步确定药物进入指甲的机理、增强指甲的证据价值和应用价值以及满足实践检测的需求，建立指甲中同时检测多种目标物的系统分析方法具有重要的实际意义。

抗精神失常及安眠镇静类物质能够影响人的思维、情感和意志等心理过程，继而改变个体的行为及活动[12]，往往成为不法分子违法犯罪的主要辅助药物，即药物辅助犯罪(Drug-facilitated crimes)，如迷奸案件及麻醉抢劫案件[13-16]。同时，长期服用部分抗精神失常及安眠镇静类物质会产生耐药性和依赖性，过量使用易引起中毒乃至死亡[17]。故此类药物始终是法庭科学领域的重点研究对象。然而，指甲中抗精神失常及安眠镇静类物质的含量低(痕量级)、极性范围广、不同物质间存在化学异质性[4]，从而对分析技术，尤其是样品处理技术提出了挑战。20世纪90年代末，本课题组首次将微波照射辅助(Microwave irradiation assisted)技术引入法医学中的生物样品分析，有效地提高了气相色谱样品预处理过程中衍生化反应的反应效能并缩短了反应时间[18]。近年来，这一技术已成为生物样品中血液[19]和尿液[20]中药物分析的热点技术，并被称为微波辅助提取技术(Microwave-assisted extraction，MAE)。本实验室在丰富的指甲研究基础上，首次将MAE运用于指甲样品的样品处理过程，以期提升和改进样品处理方法，同时为指甲分析提供多样化的样品处理手段，并采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)建立了指甲中14种抗精神失常及安眠镇静类物质的同时分析方法。文中对方法进行了系统和完整的验证，并将方法应用于7个服用抗精神失常及安眠镇静类药物的患者的指甲分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RA-E900微波炉(日本三菱集团)，MD200 样品浓缩器(杭州奥盛科技公司)；API 4000 QTRAP 三重四极杆线性离子阱质谱仪(美国Applied Biosystems公司)；AcquityTMUltra Performance LC超高压液相色谱仪(美国Waters公司)；6700冷冻研磨机(美国SPEX CertiPrep公司)；Milli-Q去离子水制备系统(美国Cerilliant公司)。14种抗精神失常及安眠镇静类物质对照品及内标：氯氮平、去甲氯氮平、氟哌啶醇、艾司唑仑、三唑仑、α-羟基三唑仑、阿普唑仑、羟基阿普唑仑、硝西泮、7-氨基硝西泮、唑吡坦、多虑平、阿米替林、卡马西平、氯氮平-d4均购自美国Cerilliant公司；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；乙酸铵(色谱纯，瑞士Fluka化学公司)；其他化学试剂及药品均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 溶液配制

14种抗精神失常及安眠镇静类物质对照品分别用甲醇制成10 μg/mL的储备液，氯氮平-d4对照品用20 mmol/L乙酸铵制成1.0 μg/mL的内标储备液，于-20 ℃冷冻保存备用。上述14种储备液(10 μg/mL)临用前以甲醇稀释合并成不同质量浓度的14种抗精神失常及安眠镇静类物质混合对照品工作溶液；1.0 μg/mL同位素内标氯氮平-d4的储备液用20 mmol/L乙酸铵稀释成25 ng/mL的内标工作溶液，于4 ℃保存。

1.3 样品收集与处理

7份含抗精神失常及安眠镇静类物质的阳性指甲样品来源于服用部分抗精神失常及安眠镇静类药物的患者，均为经临床诊断，确需使用该种抗精神失常及安眠镇静类药物进行治疗的患者。7例患者均自述每天口服相应剂量药物，至少6个月以上。详细用药信息见表1。所有指甲样品均未经过美容处理。在采样过程中，全部患者均被口头告知实验目的，并经其同意，由患者本人自行采集其已生长出指缘外的多余指甲，采集过程无损无痛。指甲样品标注后室温保存。采集健康志愿者的空白指甲样品，采用美容指甲钳沿指甲边缘剪下后，保存于洁净干燥的牛皮纸包中，于室温下避光保存。

表1 7例服用部分抗精神失常及安眠镇静类药物患者的用药信息

*:unrecorded

指甲样品置于5 mL具塞玻璃试管中，用水洗涤3次，每次3 min；再用丙酮溶液清洗两次，每次2 min。取出指甲晾干后冷冻研磨。称取指甲粉末20 mg于2 mL的Eppendor管中，加入100 μL氯氮平-d4的内标工作溶液，置于微波炉，700 W加热处理两次，每次3 min，中间间隔5 min以使体系冷却。取出后静置恢复至室温，加入400 μL甲醇，涡旋，12 000 r/min离心30 s。取上层清液于洁净Eppendor管中，待分析。

1.4 LC-MS/MS条件

1.4.1 液相色谱 液相柱为Resteck Allure PFPP五氟苯基柱(100 mm× 2.1 mm,5 μm)，前接Zorbax Extend-C18Narrow-bore 保护柱(2.1 mm×12.5 mm,5 μm)；流动相为20 mmol/L乙酸铵水溶液(A)与含20 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液(B)，梯度洗脱：0～1.0 min，40% A；1.0～1.5 min，40% ～15% A；1.5～4.5 min，15% A；4.5～5.0 min，15%～5% A；5.0～7.5 min，5% A；7.5～9.0 min，5%～40% A，流速0.4 mL/min，柱温为室温，进样量10 μL。总采样时间为9 min。

1.4.2 串联质谱 采用电喷雾电离-正离子模式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)检测。操作参数为：离子喷雾电压(IS)：5 kV；离子源温度(TEM)：500 ℃；碰撞气氮气(CAD)：5 psi(1 psi ≈ 6.9 kPa)；气帘气(CUR)：30 psi；雾化气(GS1)：40 psi；辅助气(GS2)：60 psi。

1.5 方法评价

采用行业公认的方法有效性验证体系[21]，包括选择性、检出限、线性方程、准确度(或偏倚)和精密度。基质效应参考国际上通行的Matuszewski等[22]提出的方法。

1.5.1 选择性 分别采用10个不同来源的空白指甲样品，按“1.3”方法操作，进行LC-MS/MS分析，检测指甲中内源性物质对14种目标物是否有干扰。另采用2个添加内标的空白指甲样品，按“1.3”方法操作，进行LC-MS/MS分析，检测内源性物质对内标是否有干扰。

1.5.2 线性关系与检出限 取空白指甲粉末20 mg，加入14种目标物的混合对照品工作溶液，配制成质量浓度为0.1～10 000 pg/mg的指甲样品2份，以氯氮平-d4为内标，按“1.3”方法处理、分析。以指甲中目标物的质量浓度为横坐标(X，pg/mg)，目标物和同位素内标的峰面积比(Y)为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得线性方程。以信噪比值大于3的浓度为检出限(LOD)，以线性曲线的浓度最低点(RSD≤ 20%)为定量下限(LOQ)。

1.5.3 准确度与精密度 称取空白指甲粉末20 mg，添加不同量的混合对照品溶液，分别配制成低、中、高3个质量浓度的指甲样品，每个质量浓度点6份样品，按照“1.3”方法处理、分析，连续4 d。准确度用偏倚度(bias%)表示，日内精密度(RSD)和日间RSD计算公式如下：bias(% )=(X-μ)/μ×100%；日内RSD(% )=(Sw/X)×100%；日间RSD(%)=(Sb/X)×100%。其中X为平均浓度，μ为标准添加浓度，Sw和Sb分别为日内标准偏差和日间标准偏差。

1.5.4 基质效应 测定14种目标物的低、中、高质量浓度的指甲样品各8份，比较其峰面积的平均值。其中目标物直接进样分析所得峰面积设为A，20 mg空白指甲样品提取后添加对应量的混合对照品溶液后分析所得峰面积设为B，基质效应(ME)按照以下方程计算[22]：ME(%) =(B/A) ×100%。

2 结果与讨论

2.1 方法优化

2.1.1 样品处理条件的优化 国外学者Fernandez等[23]采用MAE技术对毛发样本中的阿片类物质、可卡因及其代谢物分析进行了探索，对微波辅助提取过程的条件进行了多准则优化，结果表明微波加热温度、加热时间和释放溶剂种类及体积对目标物的释放率、基质效应等均有影响。在前期研究基础上，本实验分别考察了不同释放溶剂和微波加热时间及温度(微波功率)对指甲中各目标物释放率的影响。分别使用甲醇(有机相)和水(水相)作为释放溶剂，结果表明，在微波加热条件下，甲醇分子偶极矩快速变化，产生的热效应使得甲醇瞬间气化从而造成一种高压环境，故以甲醇为释放溶剂的MAE处理需特制的耐压装置，同时为保证非常压环境下的气液平衡，释放溶剂用量也较大；由于水的介电常数大，作为微波加热的媒介，具有安全、便捷、环保、经济的特点，因此选择水为释放溶剂。

进一步比较了不同微波能量(500，700，950 W)与不同微波处理时间(1，2，3，4 min)对释放能力的影响。结果显示，提高微波能量可有效增强目标物的释放率，延长微波处理时间也可显著提升目标物的释放，但部分热不稳定目标物在过强的微波能量(950 W)或过长的微波处理时间下释放量反而下降，认为与热降解有关。故选用700 W处理3 min×2次作为本方法的样品处理条件。

2.1.2 质谱条件的优化 在Manual Tuning模式下，使用11 plus针式进样泵对浓度约为100 ng/mL的14种目标物的混标对照品甲醇溶液进样，进样速度为10 μL/min，在11 plus针式进样泵流速恒定时，使用Q1scan扫描模式确定待测目标物的母离子碎片，并利用edit ramp功能优化DP。利用Product Ion扫描模式得到待测目标物的二级质谱图；根据其二级质谱图，选择3～4个子离子碎片。使用Mass Frontier 7.0(HighChem,Thermo Fisher,USA)软件对目标物进行理论裂解，裂解方式遵守分子在质谱中的基本裂解规则和Fragmentation library(2008,HighChem,Thermo Fisher,USA)提供的特殊裂解规则。优化母离子和子离子对的CE。使用空白添加样品及空白样品，按照“1.4.1”的液相色谱条件进行模拟分析，剔除可能会对实际样品分析产生干扰的子离子碎片，最终选定LC-MS/MS行为最优的两个子离子碎片，与母离子组成供分析使用的特征离子对。优化后的结果见表2。

表2 14种抗精神失常及安眠镇静类物质的质谱参数

2.1.3 色谱条件的优化 本研究所涉目标物数量多、目标物之间化学异质性明显，为达到适宜的分析效果，对色谱条件进行了优化。分别以Resteck Allure PFPP(100 mm× 2.1 mm,5 μm)、Zorbax SB-C18(150 mm× 2.1 mm,5 μm)和IBD(100 mm × 2.1 mm,5 μm) 3种不同色谱保留原理的液相色谱柱对指甲加标样品进行分析。结果表明，大部分目标物在C18和IBD柱上的保留行为集中，难以分离，易受到内源性干扰，而PFPP柱上各目标物在保证分离的前提下，峰形较好，拖尾现象少，从而提高了分析方法的分离效率和灵敏度。这是由于PFPP柱的键合相为丙基五氟苯，能对碱性化合物有很好的保留，其保留原理与C18及IBD柱有显著差别，对待分析目标物的pKa等属性依赖性小，各目标物在各自适宜条件下出峰，且响应高、峰形好，综合考虑选用PFPP色谱柱。

考察了甲醇-水体系流动相和乙腈-水体系流动相的分离效果。结果发现，采用乙腈为有机流动相时，洗脱能力过强，绝大多数目标物集中在1～2.5 min内出峰，难以实现化合物的良好分离；而在甲醇-水体系的流动相下，目标物能够较好分离，因此选择甲醇-水为流动相。此外，由于本实验大部分目标物为弱碱性物质，在甲醇和水中加入适量乙酸铵，能够促进弱碱性目标物的电离，增强离子响应，稳定峰形，从而提高方法的灵敏度。

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性 多反应监测色谱图表明，10个不同来源的空白指甲中的内源性物质不干扰14种目标物的测定，2个不同来源的空白指甲中的内源性物质不干扰内标物的测定，具有很好的特异性。图1为添加对照品和添加内标的指甲样品的总离子流图。

图1 添加14种对照品(A)和添加内标(B)的指甲样品的总离子流图

2.2.2 基质效应 考察了指甲中14种目标物在3种浓度水平下的基质效应(表3)。结果表明，大部分目标物的基质效应在51.0%～124.5%范围内，其中阿米替林、氟哌啶醇、艾司唑仑、α-羟基三唑仑、硝西泮和多虑平的LC-MS/MS分析基本不受指甲基质的影响(80%～120%)，氯氮平、三唑仑、阿普唑仑、唑吡坦和卡马西平受到较弱的基质抑制作用(51.0%～79.1%)，去甲氯氮平和α-羟基阿普唑仑受到较弱的基质强化作用(122.3%～124.5%)；另外，7-氨基硝西泮的基质抑制作用较强(5.0%～9.0%)，说明该方法对7-氨基硝西泮的基质干扰较大。本课题组曾对毛发样品中苯二氮卓类物质的基质效应[24]进行了研究，与指甲相比，7-氨基硝西泮在毛发中受到相对较弱的基质抑制作用(52.8%～71.4%)，故指甲基质的离子抑制作用是影响7-氨基硝西泮检出限的主要原因，但考虑到7-氨基硝西泮为硝西泮的主要代谢产物，因此仍将其放入分析物之列。同种基质对不同目标物产生的基质效应程度不同，因此应采用内标法校正，且尽量采用更有效的样品净化方法。

表3 14种抗精神失常及安眠镇静类物质的基质效应

2.2.3 线性关系与检出限 指甲中14种目标物的浓度线性范围、回归方程、回归系数和检出限(LOD)等见表4。结果表明，14种目标物在100 ～10 000 pg/mg(氟哌定醇、唑吡坦和卡马西平在500～10 000 pg/mg)含量范围内呈良好的线性关系(r2≥0.990)，LOD为0.1～50 pg/mg。除氟哌定醇、唑吡坦和卡马西平的定量下限(LOQ)为500 pg/mg以外，其他目标物的LOQ均为100 pg/mg。方法具有较高灵敏度，适合指甲中多种抗精神失常及安眠镇静类物质的高灵敏检验。

表4 14种抗精神失常及安眠镇静类物质的线性关系、检出限及定量下限

2.2.4 准确度与精密度 指甲中14种目标物在3个添加浓度(500,4 000,8 000 pg/mg)的日内精密度、日间精密度与准确度数据列于表5。所有目标物的日内精密度与日间精密度均不大于7.8%，准确度均在±10.16%范围内。由于采用的同位素内标氯氮平-d4与目标物的结构相近，理化性质相似，内标色谱峰与目标物色谱峰相互间无干扰，有效降低了样品处理和质谱电离等过程的随机误差，方法显示了较好的日内、日间精密度及准确度，可用于对指甲样品中14种抗精神失常及安眠镇静类物质的定性、定量分析。

表5 14种抗精神失常及安眠镇静类物质的精密度和准确度(%)

(续表5)

AnalyteIntra⁃RSD(n=6)Inter⁃RSD(n=24)Accuracy(Bias，n=6)500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg500pg/mg4000pg/mg8000pg/mg7⁃Aminonitrazepam203652585143-0675546Zolpidem4712155431186435-087Doxepin18211356272762-11018Carbamazepine37202147241910214-093

表6 阳性样品中部分抗精神失常及安眠镇静类物质的检测结果

+:detected,but blow LOQ;-:not detected

2.3 实际应用

使用本文建立的方法对7份服用部分抗精神失常及安眠镇静类药物患者的阳性指甲样品进行检测，结果列于表6。4例指甲样品中检出卡马西平，含量为LOD(5 pg/mg)～11 750 pg/mg；6例检出氯氮平，含量为LOD(25 pg/mg)～2 240 pg/mg，其中4例检出其代谢物去甲氯氮平，含量为LOD(5 pg/mg)～1 705 pg/mg，去甲氯氮平与氯氮平的含量比分别为0.47和0.76；2例检出阿普唑仑及其代谢物，含量高于检出限低于定量下限；氟哌啶醇和唑吡坦各有1例检出，含量均高于检出限低于定量下限。

本实验室对指甲中氯氮平的检测进行了相关报道[4]，其平均含量为138.3 pg/mg，与本实验中氯氮平的含量范围相一致。另有文献[25]报道指甲中阿普唑仑的含量为50～500 pg/mg，其中低于100 pg/mg的样品数占75%，本文的检测结果(阿普唑仑LOQ=100 pg/mg)与文献基本相符。根据Pufal等[26]的报道，手指甲和脚趾甲中氟哌定醇的含量分别为67.3(±6.49) pg/mg和98.9(±9.14) pg/mg；Favretto等[27]测得毛发中氟哌啶醇的含量为0.37～0.73 ng/mg，其LOQ为0.1 ng/mg；其他样品如尿和血液[27]中氟哌啶醇的浓度分别为2～21 ng/mL和≤4.9 ng/mL；本实验指甲样品检出氟哌啶醇，但由于氟哌定醇的LOQ(500 pg/mg)较高，无法定量。根据本实验室已报道的人体手指甲及脚趾甲中的唑吡坦含量(<1.74 pg/mg和<3.29 pg/mg)[6],认为本文研究结果与其相符；本实验的指甲样品检出唑吡坦，然而其LOQ(500 pg/mg)较高，无法定量。

3 结 论

本研究建立了微波辅助提取技术(MAE)以及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法同时分离分析指甲中14种抗精神失常及安眠镇静类物质的方法，方法快速简便，灵敏可靠，专属性强，重现性高。7例抗精神失常及安眠镇静类物质服用患者的指甲分析结果表明，应用该法可在患者指甲中检出卡马西平、氯氮平、阿普唑仑、氟哌定醇、唑吡坦原药以及去甲氯氮平、α-羟基阿普唑仑等代谢物成分。MAE技术在指甲样品中的成功应用说明了其在处理富角蛋白样品时的可行性。本研究结果可为进一步进行抗精神失常及安眠镇静类物质进入指甲机理等研究提供方法学基础和技术平台，也为深入研究指甲样品中毒、药物分析及其应用价值提供了参考依据。

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Simultaneous Determination of 14 Antipsychotic and Sedative Substances in Human Nails Using Microwave-assisted Extraction Combined with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

FENG Xue-yi1,2,CHEN Hang2,SHEN Min2*,XIANG Ping2

(1.Department of Forensic Chemistry,National Police University of China,Shenyang 110854,China;2.Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China)

A method based on microwave-assisted extraction combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry(MAE/LC-MS/MS) was established for the simultaneous determination of 14 antipsychotic and sedative substances in human nails.About 20 mg of decontaminated and pulverized nail samples was microwave-assistedly extracted for twice in the presence of clozapine-d4 used as the internal standard,and the supernatant was determined by LC-MS/MS using the Allure PFPP column with a mobile phase of methanol(containing 20 mmol/L ammonium acetate)-20 mmol/L ammonium acetate buffer.Multiple reaction monitoring(MRM) mode was used to analyze 14 antipsychotic and sedative substances.Good linearities(r2≥0.990) over the corresponding range were obtained for all the analytes.The limits of detection(LOD) were in the range of 0.1-50 pg/mg and the limits of quantitation(LOQ) were 100 pg/mg for most of the analytes.The deviations of intra- and inter-RSD were not more than 7.8%.Accuracies were within ±10.16%.Positive results were obtained from 7 authentic nail samples,which were in good accordance with the drug administration of the corresponding antipsychotic and sedative substances.The developed method presents a simplified,efficient and rapid procedure for sample preparation,and shows high sensitivity and selectivity,which is suitable for the simultaneous analysis of 14 antipsychotic and sedative substances at pg/mg levels in nail samples.

microwave-assisted extraction(MAE);liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);nails;antipsychotic and sedative substances

2016-03-18；

2016-05-03

国家级科研院所公益项目(GY2016Z-1)；国家自然科学基金面上项目(81273340)；上海市法医学重点实验室项目(14DZ2270800)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.003

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1233-08

*通讯作者：沈 敏，研究员，研究方向：法医毒理学和法医毒物分析，Tel:021-52369419，E-mail:shenm@ssfjd.cn