刺状无梗囊霉对番茄黄化曲叶病毒病田间防效

李可，高彦林，王楚南，蒋春号，郭坚华

（1.南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室/江苏省生物源农药工程中心，南京，210095；2.广州市林业和园林科学研究院）

刺状无梗囊霉对番茄黄化曲叶病毒病田间防效

李可1，2，高彦林1，王楚南1，蒋春号1，郭坚华1

（1.南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室/江苏省生物源农药工程中心，南京，210095；2.广州市林业和园林科学研究院）

利用前期试验结果筛选出丛枝菌根真菌刺状无梗囊霉XJ27，将菌根番茄苗移栽至江苏大丰市大棚中，30 d后进行生物量数据统计分析，结果发现，接种XJ27后，番茄移栽成活率以及生物量显著增加；大田间自然发病采样后，经特异性引物检测，确定为番茄黄化曲叶病毒病，经病害严重度统计后，发现刺状无梗囊霉XJ27对番茄黄化曲叶病毒病具有一定的生防效果，防效达到50.44%。

刺状无梗囊霉；促生作用；番茄黄化曲叶病毒病

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）是自然界中普遍存在的植物和真菌的互惠互利共生体，植物能够为菌根真菌提供生长需要的碳源和能量，AM真菌可以通过根外菌丝扩大根系吸收范围，从而提高植物根系对养分和水分的吸收，尤其是对土壤磷的吸收[1]。除了在改善植物养分吸收方面的作用外，AM真菌与植物病害的关系也是目前研究的重点。

随着番茄种植面积的逐年增加，我国番茄种植上陆续出现多种病害问题，其中由双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCD）为害较为严重。该病毒由烟粉虱介导传播，是一种具有孪生颗粒形态的单链环状DNA植物病毒[2]。近年来，TYLCD在世界范围内大暴发，遍及40多个国家和地区，已成为番茄生产上的毁灭性病害[3]，给农民的生产造成巨大的经济损失[4]，严重制约了番茄产业的健康发展。目前，主要通过培育抗性品种和采用化学药剂来防治烟粉虱防治该病害，但效果不稳定。国内外还没有报道对TYLCV有显著抑制效果的生防菌，国内外市场上也没有出现能有效防治番茄黄化曲叶病毒病的生物农药。本研究首次发现AM真菌可以在一定程度上降低番茄黄化曲叶病毒病的为害程度，为今后生防产品的研发以及利用奠定了一定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试番茄（Lycopersicon esculentum）品种为合作903，于江苏省农业科学研究院购买。

供试刺状无梗囊霉XJ27（Acaulospora spinosa），分离自新疆地区番茄根际土壤。实验室之前的研究表明XJ27对Micro-Tom番茄具有促生及提高果实中番茄红素含量的效果[4]。

1.2 试验方法

①田间处理以及小区设置 试验于2014年在江苏大丰市进行，共设置2个处理，即接种刺状无梗囊霉XJ27组和空白对照组（CK）。将番茄种子用10%H2O2表面消毒 10 min，用无菌水洗净后晾干备用。先在穴盘内进行菌根苗培育[4]，20 d后连根部土壤一起移栽至田间。每株番茄根部施用2 g AM菌剂（每份菌剂大约100个孢子），对照组加入等量灭菌菌剂。每个处理4个小区，每小区3垄，每垄20株，每处理共240株。生长期间按常规方法进行管理。

④移栽成活率以及生物量检测 移栽后30 d（即育苗后50 d）进行移栽成活率的统计，植株生物量的测定，每小区取24株，每处理共96株，分别测定茎粗、株高及叶片数。生物量测定方法：将植株用蒸馏水冲洗，分为地上、根，用吸水纸吸干表面水分，测定鲜质量（FW），记录叶片数。

⑤试验田土壤相关测定 番茄移栽30 d后，使用五点取样法对番茄根围土壤进行采样。采集方法：小心地从盆钵中收集根围土样和非根围土样（根围土样的样品包括3株幼苗紧紧附着于根系上的土壤），取样时，将幼苗根部挖开，小心的用刷子刷下根上附着的土样，取完后再将根部埋好，确保根部的完整性。并使用土壤养分测定仪对其速效N、P和K 3种元素进行测定。

⑥病害鉴定 使用植物DNA提取试剂盒提取植物的总DNA，利用双生病毒通用引物进行PCR扩增。

扩增引物：PF-TAATATTACCKGWKGVCCSC；PR-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA。

扩增程序：95℃预变性4 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，变性到延伸34个循环，最后72℃，10 min。

⑦病害分级标准 育苗后70 d按照TYLCD病情指数分级标准[5]进行病害严重度以及生防效果的计算。

病害严重度（%）=[∑（发病植株数×病级数）/（总植株数×最高病级数）]×100%。

生防效果（%）=[（对照病害严重度－处理病害严重度）/对照病害严重度]×100%。

1.3 数据处理

试验数据采用DPS软件统计分析，采用LSD法进行多重比较，于5%显著水平下检验各处理平均值间的差异显著性（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 番茄病害的鉴定以及生防效果测定

使用植物DNA提取试剂盒提取田间番茄病叶的总DNA，利用双生病毒通用引物进行PCR扩增。扩增出660 bp左右长度的片段，经鉴定为番茄黄化曲叶病毒（图1）。据病害分级标准，对田间病害发生情况进行统计分级，最后计算出处理组的生防效果。结果显示，刺状无梗囊霉XJ27对番茄黄化曲叶病毒病有一定的生防效果，防效为50.44%（表1）。

图1 田间病叶样品总DNA电泳图谱

表1 AM真菌对番茄黄化曲叶病毒病的生防效果

2.2 AM真菌对移栽番茄的促生作用

菌根苗移栽后50 d，刺状无梗囊霉处理组的番茄存活率、株高、茎粗以及叶片数均显著高于对照组（表2），表明刺状无梗囊霉XJ27对番茄具有一定的促生作用。

表2 AM真菌对移栽番茄的促生作用

2.3 AM真菌对土壤营养元素的影响

番茄移栽后50 d，测定其根围土壤中营养元素的变化情况。试验结果显示，AM真菌处理组显著增加了土壤中有效P的含量，增加了有效K的含量（表3）。

表3 AM真菌对番茄根围土壤营养元素的影响

3 讨论与结论

TYLCV已成为全球番茄种植的巨大威胁。检测植株体内病毒的含量有利于了解病毒的发生、流行动态，为控制其蔓延打下基础。目前，常用于检测TYLCV的方法有生物学检测法、血清学检测法和分子生物学检测法等。Martinez-Culebras等[6]设计了2对病毒引物，其中一对可以同时检测到TYLCV和 TYLCSV，另一对却只能检测到TYLCSV，因此这2对引物可以用于区别TYLCV和TYLCSV。

本试验中根据番茄前期病株症状，初步判定为病毒病害。随后采样，根据双生病毒基因组的DNA特征，设计针对该种病毒的特异性引物，使其只能检测该种病毒，最终确定该病毒为TYLCV。

最近10 a中，AM真菌被发现可以诱导植物抵御植株地上部病害[7～9]，因此当前AM真菌已经作为一种代替化学农药及杀虫剂的生物肥料及农药来研究[10～12]，为其在可持续农业发展应用中提供了理论依据 。有研究发现，使用分根系统，AM真菌对不同的病原物都具有诱导其产生系统抗性的能力。但是AM真菌的诱导系统抗病不仅仅局限于根系，Fritz等[13]的研究发现，AM真菌对番茄叶部病害同样具有抗性。研究认为，菌根植物表现出抗性主要表现为昆虫拒食素的积累[14]、抗病相关基因的转录调节[15]、分泌更多的挥发性物质，吸引蚜虫的天敌寄生蜂[16]。因此，推测AM真菌减轻病害发生程度主要是因为AM真菌在与植物的共生过程中，诱导植物地上部产生系统防御，或是诱导植物植株地上部分泌出某些物质，从而抑制了烟粉虱的传毒过程。

本试验结果表明，AM真菌可以提高番茄植株对土壤中营养元素的利用率，这与前人的研究结果相符。其原理是AM真菌活化了土壤中的难溶营养元素，使这些元素更易于被植株转运利用。本研究首次发现AM真菌对番茄黄化曲叶病毒病具有一定的生防效果，但是对其内在的机理还需进行深入研究。

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Field Efficacy of Acaulospora spinosa on Tomato Yellow Leaf Curl Disease

LI Ke,GAO Yanlin,WANG Chunan,JIANG Chunhao,GUO Jianhua
(1.College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pest,Ministry of Education/Jiangsu Province Engineering Center of Bioresource Pesticide,210095; 2.Guangzhou Institute of Forestry and Landscape Architecture)

We inoculated AMF XJ27 screened out in previous experiments on tomato seedlings,and transplanted them to the field.After 30 days,we analyzed the biomass data of different treatments.The results showed that AMF treatment had increased the biomass and survival rate of tomato.We also tested the leaf sample of disease plants,and it was diagnosed as tomato yellow leaf curl disease(TYLCD).After the determination of disease severity,the results showed that AMF XJ27 had a certain biocontrol effect on tomato yellow leaf virus disease,which was 50.44%.

Acaulospora spinosa;Growth promoting effect;Tomato yellow leaf curl disease

S641.2

A

1001-3547（2016）16-0077-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.16.030

江苏省农业科技支撑项目“防治茄果类蔬菜土传病害的微生物农药创制及示范推广”（BE2015364）

李可（1990-），女，硕士，研究方向为AM真菌防病促生功能研究与示范，电话：15918572934，E-mail：likebio@163.com

郭坚华（1966-），通信作者，女，教授，博士生导师，电话：13851713425，E-mail：jhguo@njau.edu.cn

2016-05-30