食品中黄曲霉毒素的检测与控制

郭倩（东胜区食品药品监督管理局，内蒙古东胜　017000）



食品中黄曲霉毒素的检测与控制

郭倩
（东胜区食品药品监督管理局，内蒙古东胜017000）

【摘 要】黄曲霉毒素（AFT）是由某些真菌产毒菌株产生的次生代谢产物，具有极强的毒性、致癌性，在自然界中普遍存在。随着技术的发展和各国的重视，其检测方法也不断发展。本文就高效液相色谱法、薄层色谱法、免疫分析法等几种AFT检测技术作论述，简述了AFT的控制措施及对其检测方法的发展作了展望。

【关键词】黄曲霉毒素检测控制

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉（Aspergillus flavus，Aspergillus nomius）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等多种真菌产生的次级代谢产物，是一类化学结构相似且毒性极强的物质，目前已分离鉴定的约有20种，其中以B1、B2、G1、G2和M1、M2为主。在天然污染的食品中以B1最为多见，其毒性和致癌性也最强［1］。黄曲霉毒素对人类和家畜的健康危害很大［2］。据世界粮农组织（FAO）报告，全球每年约有2%的农作物因受其污染而失去营养和经济价值［3］。近年来，进出口商品中均有黄曲霉毒素超标现象，因此黄曲霉毒素已经成为出入境食品安全检测的重要项目。

1　黄曲霉毒素的检测方法

1.1高效液相色谱法（HPLC）

HPLC因其高效、快速、灵敏度高、重现性好、准确可靠等优点，成为黄曲霉毒素定量测定应用最广的方法。MycoSep系列多功能净化柱（MFC）是专用于霉菌毒素分离纯化的固相萃取柱，其最大优点是可一步完成净化过程，且净化效果理想［4］。

反相HPLC（RP-PLC）采用填充硅胶颗粒的流动池的荧光检测，灵敏度可以达到1ng水平以下。为了加强荧光，一般通过强氧化剂（TFA等）或卤族元素及衍生物在柱前或者柱后进行衍生处理［5］。

林裕［6］用高效液相色谱法检测黄曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2，认为该方法操作安全、快速、准确度高、精密度好。

免疫亲和层析净化高效液相色谱法是HPLC的一种，被我国定为国标方法［7］。该方法基本操作是先将试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取，提取液经过滤、稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别进行定量分析［8］。

然而一直困扰人们的问题是荧光检测器对四种AFT分子具有选择性，即对B2、G2的灵敏度高，而对B1、G1的灵敏度很低。因此，通常用两种方法来提高B1和G1的荧光性：一是通过改变流动相或改进检测器来降低物质荧光性的损失，二是对荧光性弱的物质进行柱前或柱后衍生以增强其荧光性。

1.2薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法（TLC）的原理是利用样品中的黄曲霉毒素与其他物质在固定相硅胶和流动相中的分配系数不同，达到分离的目的，再用365 nm波长的紫外线激发黄曲霉毒素产生荧光，根据荧光的强弱与标准品比较测定其含量。1990年该方法被列为AOAC标准方法。本法既可用于定性分析，也可用于定量测定；既可目测，也可用紫外分光光度计、荧光光度计定量［9］。TLC法是检测AFB1的经典方法，仍为普通实验室的常用方法［10］。

目前，在TLC法基础上又发展了高压薄层色谱法（overpressured Thin Layer Chromatograp，OPTLC）［11］。OPTLC是Tyihak在1979年提出的，它结合了经典薄层色谱法、高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点而发展起来的一种能提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。

1.3免疫学方法

1.3.1酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附测定法是免疫酶技术的一种，1966年建立了ELISA法，1971年又提出了用可溶性抗原或抗体与固相载体结合，而保留免疫成分的反应性的酶联免疫吸附试验（ELISA）［5］。其原理是：样品中的黄曲霉毒素B1与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较来测定含量。该方法灵敏度高，特异性强， 检测结果稳定准确，实验操作污染少，一次实验可检测多个样品。我国应用酶联免疫方法测定食品中黄曲霉毒素的方法原理是：试样中的AFB1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量［11］。

目前，研究人员将酶联免疫吸附法（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）两种方法结合使用。这种方法的优点是既可以快速筛检大量阴性样品，同时又能准确检测阳性样品中每种AFT的含量。2005年，柳洁等［12］将样品首先用直接竞争ELISA方法初筛测定，阳性样品再用免疫亲和柱净化、荧光检测器测定的HPLC方法验证和准确定量AFT。将两种方法结合使用，可利用检测方法各自的优点，既可以快速筛检大量阴性样品，节省时间，同时又能准确检测阳性样品中每种AFT的含量，在经济上也更节省。

1.3.2免疫亲和柱-荧光光度计法

该法以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为检测工具的快速分析方法，克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、有异味的有机溶剂对操作人员造成身体伤害和污染环境的缺点。同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快，一个样品只需要10-15min，比传统方法快几个小时甚至几天时间，仪器设备轻便、容易携带，自动化程度高、操作简单，能直接读出测试结果［11］。

1.4其他检测方法

1.4.1AFT快速检测卡

拜发公司提供AFB1和AFT Total速测卡。前者基于免疫胶体金技术，即氯金酸在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶体溶液，由于静电作用而呈稳定的胶态，故称胶体金。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附剂胶体金颗粒表面的包被过程。球形颗粒对蛋白有很强吸附性，可与各种蛋白、多肽成缀合物，利用金颗粒高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，显微镜下可见黑褐色，当这些标记物在相应配体出处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于AFB1和B2定性或半定量检测。后者基于通常的酶联免疫方法，将单克隆抗体连接在卡的膜上，检测黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的总量，检测限可调为4-30 ng.g-1［13］。

1.4.2激光诱导荧光（LIF）-高效毛细管电泳（HPCE）

马良等［14］采用自行设计搭建的激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）-高效毛细管电泳（（high per-formance capillary electrophoresis，HPCE）检测平台，建立LIF-HPCE法对食品中的黄曲霉毒素B1进行高灵敏度检测。本研究拟首次采用自行搭建的LIF-HPCE检测平台，对AFB1进行激光诱导荧光检测，采用胶束电动高效毛细管电泳模式检测分离AFB1，建立高灵敏度AFB1的LIF-HPLC检测技术，为粮油等农产品、食品中AFB1的高灵敏度检测提供技术手段。

1.4.3微柱筛选法

微柱筛选法是将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，AFT被硅镁吸附剂吸附，在365 nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与AFT的含量成正比，由于微柱不能分离AFB1、B2、G1、G2，故检测结果为AFT的总量［13］。

1.4.4水平衰减全反射比傅立叶变换红外光谱法

采用水平衰减全反射比技术获得傅立叶变换红外光谱，可用来检测AFT的含量，这是一种较新的检测分析方法［5］。Mirghani等采用此方法测定了花生及花生饼中AFT（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的含量。检测时用AFT标准品校准，无需对基质进行预分析。

2　黄曲霉毒素的控制

目前，对于黄曲霉毒素的控制方法方面的报道还不是很多，但是可以通过改变食物的贮存条件来达到控制黄曲霉毒素产生的目的。黄曲霉毒素普遍存在于酶变的大米、花生食品中。有实验证明，在温度28℃-30℃，相对湿度80%以上的条件下最适合黄曲霉的生长［6］。因此，在制定黄曲霉毒素的控制措施方面应从食物的储存条件及方法方面入手。首先，粮食及食品的储存应保持在低温状态下。其次，较高的相对湿度下，黄曲霉毒素容易产生。所以，控制环境的相对湿度也是控制黄曲霉毒素产生的方法之一。另外，及时清理霉变粒也是一个行之有效的方法。

3　展望

鉴于AFT的毒性及在食品中的广泛污染，世界各国相继建立或正在改进检测该毒素的方法。纵观其发展趋势，主要有两个发展方向，即对现有方法的改进和新方法的开发。在现有方法的改进方面，利用免疫学原理建立的检测方法及速测技术，如酶联免疫法、酶联免疫试剂盒等，将会是以后发展的主流，并将在黄曲霉毒素的检测中占主要地位；在新方法的发方面，对可能产生黄曲霉毒素的原材料，如谷物中的霉变粒，进行监控方法的研发将会是一个发展趋势。

参考文献：

［1］蔡其洪.黄曲霉毒素检测方法的应用及进展［J］.现代食品科技，2005，22（2）:233-236.

［2］张宸，岳田利，高振鹏，王军.食品中黄曲霉毒素B1检测方法研究进展［J］.农产品加工，2008，（7）:18-21.

［3］刘艳丽，程安春，汪铭书.黄曲霉毒素及其检测方法的研究进展［J］.黑龙江畜牧兽医，2006，（6）:15-17.

［4］柳洁，何碧英.高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究［J］.现代预防医学，2002，29（2）:137-139.

［5］肖紫兰，罗超，李逢慧，等.黄曲霉毒素定性与定量检测方法概述［J］.饲料博览2008，（12）:23-24.

［6］林裕.高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素［J］.中国热带医学，2006，6（4）:677-678

［7］郑荣，毛丹，王柯，等.基质固相分散色谱法检测辣椒产品中的黄曲霉毒素［J］.色谱，2005，25（6）:610-613.

［8］高军侠，万吴雷，刘作新.Florisil柱净化玉米.水稻及糙米［J］.2005，37（2）:101-104.

［9］罗超，李逢慧.黄曲霉毒素检测方法研究概况［J］.动物医学进展，2008，（29）:37-39.

［10］张岑，曾庆孝，朱志伟，等.黄曲霉毒素的快速检测方法“科技创新与食品产业可持续发展”学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文集:210-215.

［11］赵飞，焦彦朝，连宾，等.黄曲霉毒素检测方法的研究进展［J］.贵州农业科学，2006，34（5）:123-126.

［12］柳洁，何碧英，孙俊红.ELISA和免疫亲和柱HPLC方法测定粮油食品中黄曲霉毒素B1［J］.现代预防医学，2005，32（6）:653-655.

［13］熊丽，陆琳，罗超，等.黄曲霉毒素的危害及检测方法的研究进展［J］.畜牧兽医杂志，2008，27（3）:39-40.

［14］马良，张宇昊，李培武.LIF-HPCE法检测食品中的黄曲霉毒素B1 ［J］.食品科学，2009，30（10）:135-139.

【Abstract】Aflatoxins，a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains and to have extremely toxic，potent carcinogenic and ubiquitous in the environment.Along with technological development and national attention，its detection methods have also developed continuously.The methods and application of HPLC、TCL、Immunoassay and other detecting methods were discussed in the paper，and the control measures were introduced briefly.The prospect of detecting methods of AFT was also explained for the future.

【Key words】AFTDetectionControl