疗癣卡西甫散提取物对肿瘤坏死因子—α诱导角质形成细胞增殖的影响

彭晓明 高莉 霍仕霞 赵茉 闫明

摘要：目的 观察疗癣卡西甫散提取物（LE）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导角质形成细胞株HaCaT细胞增殖及白细胞介素-8（IL-8）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表达的影响，探讨其作用机制。方法 将培养的HaCaT细胞分为正常组、TNF-α组和LE低、中、高剂量组。除正常组外，其余各组细胞均给予40 ng/mL TNF-α诱导，各给药组再分别给予8、40、200 μg/mL LE作用48 h。MTT法检测HaCaT细胞增殖；ELISA检测HaCaT细胞IL-8和ICAM-1含量；PI和Hoechst33342荧光染色观察HaCaT细胞凋亡；半定量RT-PCR检测HaCaT细胞IL-8和ICAM-1的mRNA表达。结果 与正常组比较，TNF-α组HaCaT细胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表达明显升高（P<0.05，P<0.01）；与TNF-α组比较，LE各剂量组HaCaT细胞吸光度、IL-8和ICAM-1含量及其mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 LE通过促进HaCaT细胞凋亡及抑制HaCaT细胞IL-8和ICAM-1基因表达，从而维持皮损处HaCaT细胞的正常水平。

关键词：疗癣卡西甫散提取物；肿瘤坏死因子-α；HaCaT；细胞增殖；白细胞介素-8；细胞间黏附分子-1

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0067-04

Abstract： Objective To investigate the effects of extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders （LE） on proliferation and transcription of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT induced by TNF-α； To discuss its mechanism of action. Methods Cultured HaCaT was assigned into normal group， TNF-α group and low-， medium- and high-dose of LE group. Every group was induced by 40 ng/mL TNF-α except for normal group， and then LE groups were treated by different concentrations （8， 40， 200 μg/mL） of LE for 48 h. The proliferation of HaCaT was evaluated by MTT and the apoptosis was detected by inverted fluorescence microscope. Levels of IL-8 and ICAM-1 in HaCaT were assessed by ELISA， and their mRNA expressions was detected by semi-quantitative RT-PCR. Results Compared with normal group， the absorbency of HaCaT and the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 increased in TNF-α group （P<0.05， P<0.01）； compared with TNF-α group， LE of all dose groups could significantly inhibit the absorbency， decrease the contents and mRNA expressions of IL-8 and ICAM-1 （P<0.05， P<0.01）. Conclusion LE is able to inhibit the proliferation of HaCaT induced by TNF-α， and the mechanism is probably related to promoting apoptosis and down-regulating the gene expressions of IL-8 and ICAM-1， and then maintaining the normal level of HaCaT.

Key words： extracts of Liaoxuan Kaxifu Powders； TNF-α； HaCaT； proliferation； IL-8； ICAM-1

银屑病是一种免疫系统参与的慢性、炎症性、复发性皮肤病。疗癣卡西甫散是维吾尔医治疗银屑病的常用复方，由欧菝葜、菝葜、黄连和芝麻（白）组成，具有燥湿、止痒、清除碱性异常黏液质的作用[1]。临床应用及动物实验表明，疗癣卡西甫散对角质形成细胞的增殖具有显著抑制作用，但其作用机制尚不清楚[2-3]。本实验观察疗癣卡西甫散提取物（LE）对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导角质形成细胞株HaCaT细胞增殖及白细胞介素-8（IL-8）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表达的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物及制备

LE，本实验室自制，欧菝葜、菝葜、黄连和芝麻药材购自新疆本草堂中药饮片有限公司，经新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所斯拉甫·艾白主任药师鉴定为正品。将药材粗粉按处方比例与芝麻混合，加入10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，提取液过滤浓缩后，冷冻干燥至浸膏。然后称取0.1 g LE，加500 μL DMSO超声溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2 细胞株

人永生化角质形成细胞株HaCaT，中国典型培养物保藏中心。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM（高糖）培养基，GIBCO公司；胎牛血清，Hyclone公司；TNF-α、MTT、氨苄青霉素钠和硫酸链霉素，Sigma公司；Hoechst33342/PI Kit，上海美季生物技术有限公司；人IL-8、ICAM-1 ELISA kit，R&D;公司；TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、DNA Marker、PCR Master Mix、Taq酶，北京天根生物科技有限公司；TRIpure LS Reagent总RNA抽提试剂，北京百泰克生物科技有限公司。超净工作台（苏净，SW-CJ-1F），倒置荧光显微镜（上海光学六厂，37XAY），CO2培养箱（SANYO，MCO-18AIC），酶标仪（ThermoFisher，Multiskan Go 1510），PCR仪（PE，GeneAmp PCR system 9700）。

2 实验方法

2.1 细胞培养、分组、给药及细胞增殖检测

将HaCaT细胞以5×105个/mL接种于含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、链霉素的DMEM（高糖）培养基中，置于37 ℃、CO2培养箱培养，每隔3 d换液1次。当细胞融合约80%时，0.25%胰酶消化，DMEM培养基将细胞稀释至5×104个/mL，接种于96孔培养板，培养48 h后吸弃培养基。将HaCaT细胞分为正常组、TNF-α组和LE低、中、高剂量组（以DMEM培养基稀释）。除正常组外，其余各组均给予40 ng/mL TNF-α诱导，同时LE各剂量组分别加入8、40、200 μg/mL LE。将HaCaT细胞置于37 ℃、CO2培养箱48 h后，加入5 mg/L MTT 20 μL/孔，继续培养4 h。吸弃培养液，加入DMSO 200 μL，充分震荡溶解后，于酶标仪波长490 nm处测定光密度（OD）值。

2.2 ELISA检测白细胞介素-8、细胞间黏附分子-1含量

细胞给药处理后，吸取细胞培养上清液用于测定IL-8和ICAM-1。稀释标准品并设定标准孔15个，空白孔3个。空白孔和测定孔分别加入40 μL样品稀释液，然后吸取测定样品10 μL加入待测孔，37 ℃温育30 min，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。然后每孔加50 μL酶标试剂（空白孔除外）。37 ℃温育30 min、洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL后，于酶标仪450 nm处测定OD值。之后以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程，并由线性回归方程得出测定样品IL-8和ICAM-1含量。

2.3 倒置荧光显微镜观察HaCaT细胞凋亡

以DMEM（高糖）培养基调节HaCaT细胞浓度至5×105个/mL，铺至25 cm3培养瓶培养48 h，分组及给药同“2.1”项。然后以0.25%胰酶消化，收集各组细胞1×106个以上。室温1000×g离心10 min，PBS洗涤3次，收集细胞，并重悬于200 μL PBS中，加入PI和Hoechst33342各20 μL（终浓度分别为50、10 mg/L），于37 ℃孵育10 min。然后1000×g离心10 min，弃上清，加入80 μL PBS，吹打混匀，滴片，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.4 引物设计与合成

根据NCBI网站上报道基因序列，利用Premier5.0软件设计内参基因GAPDH及目的基因IL-8和ICAM-1的引物。GAPDH（458 bp）：上游5'-GACCAC AGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TGAGGTCCACC ACCCTGTTGC-3'；IL-8（292 bp）：上游5'-ATGCCA CTGAAACTGCTTCAAGC-3'，下游5'-GTTCGGATA TTCTCTTGGCC-3'；ICAM-1（185 bp）：上游5'-GAG GGGTCTCAGCAGACTCTT-3'，下游5'-TGCACGTC CCTGGTGATACT-3'。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.5 半定量RT-PCR检测白细胞介素-8、细胞间黏附分子-1的基因表达

细胞分组及给药同“2.1”项，根据TRIpure LS Reagent总RNA抽提试剂说明书，提取给药后HaCaT细胞总RNA，测定RNA浓度，并将各组RNA浓度调节一致。按TIANScript RT Kit TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行RT-PCR。PCR反应条件为：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，30个循环后72 ℃延伸10 min，然后冷却至4 ℃。吸取10 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳。紫外透射仪下观察结果并拍照，通过Tannon凝胶成像系统测定条带光密度值，计算每个样本IL-8、ICAM-1 mRNA表达水平，均以ICAM-1和GAPDH的OD值比值表示。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 疗癣卡西甫散提取物对HaCaT细胞增殖水平及白细胞介素-8和细胞间黏附分子-1含量的影响

与正常组比较，TNF-α组HaCaT细胞OD值及IL-8、ICAM-1含量明显增加（P<0.01）；与TNF-α组比较，LE各剂量组HaCaT细胞吸光度及IL-8、ICAM-1含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。

4.2 疗癣卡西甫散提取物对HaCaT细胞凋亡的影响

正常组和TNF-α组HaCaT细胞形态规整、细胞核较大，大多被Hoechst33342染成蓝色，且2组坏死细胞（红色）数目差异不明显。但经不同浓度LE作用48 h后，视野中正常或早期凋亡细胞（蓝色）逐渐减少，而被PI红染的坏死细胞数量逐渐增加。且LE浓度在8～200 μg/mL范围内，其对HaCaT细胞凋亡诱导作用强度呈现一定浓度依赖性。结果见图1。

4.3 疗癣卡西甫散提取物对HaCaT细胞白细胞介素-8和细胞间黏附分子-1基因表达的影响

与正常组比较，TNF-α组HaCaT细胞IL-8和ICAM-1 mRNA表达明显升高（P<0.05，P<0.01）；与TNF-α组比较，LE各剂量组HaCaT细胞IL-8和ICAM-1 mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01），并呈现一定的浓度依赖性。结果见表2、图2、图3。

5 讨论

银屑病的发病机制至今尚未明确。维吾尔医理论认为，该病多见于异常黏液质体液人群，人体在咸味异常黏液质的影响下，导致机体内异常物质增多，并通过血液影响到皮肤组织。然后反复刺激皮肤、破坏皮肤正常的物质代谢，影响皮肤的影响力、摄住力、生长力等，从而导致银屑病。银屑病患者皮损病理特征表现为HaCaT过度增殖及分化异常。现代医学研究表明，TNF-α是银屑病斑块形成和HaCaT细胞增殖过程中的首要细胞因子[4]。本实验通过40 ng/mL TNF-α诱导HaCaT细胞，成功模拟获得银屑病皮损细胞异常增殖症状。8、40、200 μg/mL LE干预后，可显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖，促进HaCaT细胞凋亡，且其细胞增殖抑制和凋亡促进作用呈现浓度依赖性。

炎症前细胞因子如IL-6和IL-8在银屑病皮损中过度表达，可导致银屑病的病理改变[5-6]。ICAM-1作为一种重要的炎症因子，不仅可促进细胞间的黏附，还在诱导炎症细胞的聚集、活化损伤反应中起着重要的作用。在体实验发现，抗ICAM-1单克隆抗体能明显抑制白细胞与内皮细胞的黏附，从而减轻炎症反应[7]。本研究结果显示，经TNF-α诱导后，HaCaT细胞IL-8和ICAM-1含量及mRNA表达显著上调，而经8～200 μg/mL LE作用48 h后，其可显著降低HaCaT细胞IL-8和ICAM-1的生成及mRNA表达。

综上所述，LE对TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖具有抑制作用，其作用机制可能与LE促进HaCaT凋亡及抑制HaCaT细胞IL-8和ICAM-1基因表达水平，进而维持皮损处HaCaT细胞的正常水平相关。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部“药品标准”—维吾尔药分册（第1版）[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：139.

[2] 张迪，宋洋，兰岚，等.疗癣卡西甫丸加百癣夏塔热片治疗老年人寻常型银屑病的临床观察[J].中国老年学杂志，2013，33（16）：4074-4075.

[3] 彭晓明，霍仕霞，吴培培，等.疗癣卡西甫散的药效学研究[J].中国医药导报，2011，8（11）：64-66.

[4] 林景荣，刘晓明.银屑病发病中角质形成细胞的增殖和凋亡与端粒酶的表达[J].中国医师进修杂志，2006，29（3）：69-70.

[5] OCKENFELS H M， WAGNER S N， KEIM-MAAS C， et al. Lithium and psoriasis：cytokine modulation of cultured lymphocytes and psoriatic keratinocytes by lithium[J]. Arch Dermatol Res，1996， 22（8）：173-178.

[6] ASADULLAH K， DOCKE W D， VOLK H D， et al. The pathophysiological role of cytokines in psoriasis[J]. Drugs Today（Barc），1999，5（8）：913-924.

[7] CLARK W M， MADDEN K P， ROTHLEIN R， et al. Reduction of central nervous system ischemic injury by monoclonal antibody to inter cellular adhesion molecule[J]. J Neurosurg，1991，75（4）：623- 627.