丹参通络解毒汤对骨髓干细胞移植急性心肌梗死模型大鼠炎症反应的影响

李鑫辉 李雅婧 黄淼鑫 杜建芳 许福丽 肖青 郭晨鹤

摘要：目的 观察丹参通络解毒汤对骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植急性心肌梗死（AMI）模型大鼠炎症反应的影响，探讨其作用机制。方法 采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离、培养BMSCs。结扎冠状动脉左前降支建立AMI模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs组，每组10只。BMSCs细胞悬液直接注入梗死区边缘心肌组织；各组大鼠给予相应药物或生理盐水灌胃。4周后，ELISA测定大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、可溶性细胞间黏附因子-1（sICAM-1）含量，Western blot测定心肌组织Toll样受体4（TLR-4）蛋白表达，HE染色观察心肌组织病理形态。结果 与模型组比较，BMSCs组、丹参通络解毒汤组、丹参通络解毒汤+BMSCs组大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量及心肌组织TLR-4蛋白表达均显著降低（P<0.05，P<0.01），且丹参通络解毒汤组优于BMSCs组（P<0.05，P<0.01），丹参通络解毒汤+BMSCs组优于BMSCs组、丹参通络解毒汤组（P<0.05，P<0.01）。结论 BMSCs移植联合丹参通络解毒汤能够抑制AMI模型大鼠的炎症反应，修复缺血心肌组织，其机制可能与调节TLR-4介导的炎症反应有关。

关键词：丹参通络解毒汤；急性心肌梗死；单核细胞趋化蛋白-1；可溶性细胞间黏附因子-1；Toll样受体4；炎症反应；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0057-05

Abstract： Objective To explore the effects of Danshen Tongluo Detoxication Decoction on the inflammatory response of rats with bone marrow stem cell （BMSC） transplantation in acute myocardial infarction （AMI）； To discuss its mechanism of action. Methods The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. After the modeling， SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group and BMSCs group （BMSCs transplantation group）， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group， 10 rats in each group. BMSCs cell suspension was injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area； Chinese medicine or normal saline were administered for gavage. 4 weeks later， the contents of MCP-1 and sICAM-1 in each group were detected by ELISA. TLR-4 expression was measured by Western blot method， and HE staining was used to observe the myocardial tissue pathological changes. Results Compared with the model group， the contents of MCP-1 and sICAM-1 and the protein expression of TLR-4 in BMSCs group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group decreased， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group was better than BMSCs group （P<0.05， P<0.01）， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group was better than BMSCs group and Danshen Tongluo Detoxication Decoction group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion BMSCs transplantation combined with Danshen Tongluo Detoxication Decoction can restrain the inflammatory response of AMI model rats and repair ischemic myocardium issue， which mechanism may be related to regulating TLR-4 induced inflammatory response.

Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致残率逐年增高，成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。近年来骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、体外扩增能力强、可来源于自身、应用于临床的可行性高等优势[1]，成为治疗AMI新途径研究的热点。研究显示，BMSCs的应用可促进心肌组织细胞再生，刺激梗死区毛细血管新生，调节梗死区域心肌组织细胞的凋亡，改善心脏功能[2]。同时，有实验研究表明，中药干预BMSCs可调控BMSCs的归巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，为BMSCs移植提供良好微环境[3]。丹参通络解毒汤由丹参、水蛭、玄参、黄连等配伍组成，全方具有益气活血、通络解毒功效，临床治疗冠心病疗效显著[4]。为研究该方对AMI后大鼠的抗炎作用，本实验通过结扎冠状动脉左前降支的方法构建AMI大鼠模型，观察丹参通络解毒汤对大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、可溶性细胞间黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌组织Toll样受体4（TLR-4）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

10～12周龄清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±30）g，用于移植；4～6周幼龄大鼠20只，雌雄各半，体质量（100±10）g，湖南中医药大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通饲料饲养，自由饮食，12 h/ 12 h明暗环境交替。

1.2 药物

丹参通络解毒汤（丹参15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，当归15 g，红花10 g，玄参15 g，黄芩10 g，栀子15 g，黄连6 g，黄芪30 g等），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，由该院制剂室煎煮，浓缩至含原药材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

MCP-1、sICAM-1 ELISA试剂盒、TLR-4单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP标记二抗，上海碧云天生物技术有限公司。SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；Galaxy型CO2培养箱，英国New Brunswick公司；倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯；多导生理信号采集系统，成都仪器厂；DW-2000型动物人工呼吸机，上海嘉鹏科技有限公司；mini protean 3 cell型电泳仪，BIO-RAD公司。

2 实验方法

2.1 骨髓间充质干细胞制备和培养

从4～6周清洁级雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集细胞，采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法进行分离、培养。经多次换液和消化，将传至P3的BMSCs采用流式细胞仪检查细胞表面抗原，以CD34阳性率低于5%及CD90、CD44阳性率高于95%鉴定所得细胞为高纯度的BMSCs。

2.2 造模

参照文献[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，气管插管连接小动物呼吸机，开胸暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳右缘之间交点和心尖的假想连线中下1/3处穿线结扎。以心电图出现QRS波群增高增宽伴ST段抬高、心肌组织颜色发绀为结扎成功；以结扎部位以下心肌组织搏动减弱、颜色变苍白，及心电图显示肢体Ⅱ导联R波振幅升高、QRS波改变、J点偏移超过0.1 mV或出现病理性Q波，证实大鼠AMI造模成功[6]。

2.3 分组及给药

当P3或P4代大鼠BMSCs达70%～80%融合时进行移植。SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、丹参通络解毒汤组（中药组）、丹参通络解毒汤+BMSCs组（中药+BMSCs组），每组10只。假手术组只穿线不结扎，其余各组进行AMI造模。BMSCs组和中药+BMSCs组冠状动脉结扎30 min后，于心肌梗死区边缘心肌组织3个位点直接注入共100 μL BMSCs细胞悬液（含细胞数3×106），假手术组和模型组则注入100 μL PBS。术后各组分笼饲养，给予常规饲料和饮水，48 h后，每日9：00中药组和中药+BMSCs组给予1 mL/100 g丹参通络解毒汤药液灌胃，其余各组用给予等量生理盐水灌胃，连续14 d。

2.4 心肌组织病理改变的观察

术后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血后，脱颈处死大鼠，迅速取出心脏，用冰生理盐水冲洗，取左心室缺血处心肌组织置于100 g/L多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片（厚4 μm），HE染色观察心肌组织的病理改变。

2.5 血清单核细胞趋化蛋白-1、可溶性细胞间黏附因子-1水平测定

术后4周，采集大鼠腹主动脉血5 mL，3500 r/min离心10 min，取血清，ELISA检测MCP-1、sICAM-1水平，严格按试剂盒说明书进行操作。

2.6 心肌组织Toll样受体4蛋白表达测定

提取心肌组织梗死边缘区心肌组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，电泳后电转于NC膜上，5%脱脂牛奶4 ℃封闭过夜。孵育TLR-4抗体（1∶500）过夜。TBST洗涤3次，加入1∶15 000稀释的荧光二抗，室温避光孵育2 h，TBST洗涤3次，通过荧光扫描仪采集信号，应用Quantity One软件分析计算灰度值。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，进行方差齐性检验，方差齐采用方差分析，方差不齐采用非参数检验或Welch检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 丹参通络解毒汤对模型大鼠心肌组织病理形态的影响

假手术组心肌组织未见明显的病理形态改变，横纹较清晰；模型组大鼠心肌组织病理形态改变较明显，心肌组织间质炎性细胞浸润、细胞肿胀明显，部分心肌组织细胞变性、坏死，肌束排列不整齐；干细胞移植组细胞肿胀及肌束紊乱程度较模型组减轻；中药组有炎性细胞浸润，细胞肿胀轻度，肌束紊乱程度有所改善；中药+BMSCs组肌束排列较整齐，细胞肿胀轻度，炎性细胞浸润改善，细胞溶解情况减少。结果见图1。

4.2 丹参通络解毒汤对模型大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1、可溶性细胞间黏附因子-1含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明显降低（P<0.05），其中，中药组优于BMSCs组，中药+BMSCs组优于中药组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.3 丹参通络解毒汤对模型大鼠心肌组织Toll样受体4蛋白表达的影响

假手术组心肌组织有少量TLR-4表达，模型组TLR-4表达明显增多（P<0.01）；各给药组较模型组TLR-4表达明显减少（P<0.01），其中，中药组优于BMSCs组（P<0.01），中药+BMSCs组优于中药组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2、图2。

5 讨论

AMI后，由于组织缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎症调节系统，诱导心肌组织细胞坏死、凋亡等梗死后效应，机体为了清除坏死细胞，又进一步激活炎症反应，从而导致心肌组织损伤[7]，故通过调节AMI后免疫炎症反应来减轻心肌组织缺血性损伤十分关键。AMI是一个急性炎症过程，大量实验研究表明，ICAM-1可以介导白细胞和内皮细胞的滚动和稳定黏附，并在MCP-1等炎性因子的协助下启动局部的炎症反应，AMI后MCP-1、sICAM-1呈高表达状态[8-9]。sICAM-1为ICAM-1在组织损伤后经蛋白酶裂解脱落存在于血清中的可溶性形式。TLR-4作为炎性反应的跨膜受体，可通过MyD88依赖性及非依赖性细胞信号转导途径实现NF-κB早期及晚期的活化，致使ICAM-1的表达量上调[10]，并促使MCP-1等趋化因子的合成及释放，开启炎症反应。因此，TLR-4与sICAM-1、MCP-1关系密切，都参与AMI过程。本实验结果显示，AMI后大鼠心肌组织TLR-4表达增加，而血清sICAM-1、MCP-1水平也呈现高表达状态，提示AMI可能通过TLR-4激活核因子-κB，从而诱导sICAM-1、MCP-1的表达和释放，参与AMI的病理过程。

BMSCs是一种存在于骨髓组织中具有自我增殖及能分化为心肌组织细胞、血管内皮细胞潜能的多能干细胞。无论是在动物模型研究还是临床前试验中，通过BMSCs移植治疗缺血性疾病都取得了显著的成果[11-12]。有研究显示，BMSCs不仅具有独特的免疫学特性，还能在移植后在宿主体内存活并对AMI后病理性免疫反应起到一定的调节作用。中药干预BMSCs移植可促进BMSCs的归巢、定植及分化，为BMSCs移植提供良好微环境，从而提高移植后的成活率，增强对缺血心肌组织的保护作用[13]。前期实验研究表明，疏肝活血中药可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形态和心功能[14]，益气活血方对骨髓干细胞具有动员作用[15]。

冠心病属中医学“心痛”“胸痹”“真心痛”等范畴，其发病主要是由于六淫犯心、七情内伤、饮食不节、年老体弱等致心脏的阴、阳、气、血亏损，痰浊、瘀血、气滞、寒凝等阻于心络。然而，外邪和内邪在机体中积聚日久，逐渐蕴积成毒，毒损心络，导致心络不通，即使心肌组织再灌注治疗血液再通，但缺血心肌组织原有代谢毒物未能排出，再灌注产生的氧自由基和炎症因子等新的“浊毒”对心体的损害又进一步加重。丹参通络解毒汤是多年临床经验方，由丹参、玄参、黄芩、水蛭、川芎等组成，方中丹参主要有效成分丹参酮和丹酚酸具有扩张冠状动脉、防止心肌组织缺血和心肌梗死、改善微循环、降低心肌组织耗氧量、抑制炎症反应等作用[16]；川芎有效成分川芎嗪可改善冠状动脉的血液循环，减轻心肌组织缺血后心肌组织细胞损伤，减少梗死面积[17]；玄参提取物降低炎症细胞因子过量表达，对心肌组织具有明显保护作用[18]；黄芩有效成分黄芩素、黄芩苷具有抗氧化、清除自由基的作用，从而修复损伤心肌组织[19]。全方具有益气活血、通络解毒的功效。本实验结果显示，该方能有效降低AMI大鼠血清sICAM-1、MCP-1含量，减少心肌组织TLR-4的表达，明显改善心肌组织病理形态，提示丹参解毒通络汤可能通过抑制TLR-4激活，减少sICAM-1、MCP-1的表达和释放，从而抑制AMI后的炎症反应，修复心肌组织损伤。并且，丹参通络解毒汤联合干细胞移植对大鼠AMI后干预作用较单纯丹参通络解毒汤和单纯干细胞移植干预作用更为显著，提示丹参通络解毒汤与BMSCs移植的联合作用，可以通过抑制TLR-4激活，增强对梗死心肌局部炎症的抑制作用，进而加强对梗死心肌的修复作用，减轻心室重构。

综上所述，丹参通络解毒汤联合干细胞移植可以抑制大鼠AMI后炎症反应，改善急性心肌组织缺血大鼠的心肌损伤，其机制可能是通过调节TLR-4介导的炎症反应实现的。

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