MSTN基因在1～6月龄哈萨克羔羊脂肪中相对表达量的研究

祖玲玲，姚丽丹，依明·苏莱曼，马晓燕，决肯·阿尼瓦什

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052）

MSTN基因在1～6月龄哈萨克羔羊脂肪中相对表达量的研究

祖玲玲，姚丽丹，依明·苏莱曼，马晓燕，决肯·阿尼瓦什

（新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052）

探索MSTN（生长抑制素）基因在脂肪组织中不同生长阶段的表达差异，为哈萨克羔羊的良种选育提供遗传学资料。采用荧光定量1～6月龄哈萨克羔羊脂肪组织中MSTN基因的相对表达量，2-ΔΔCt处理不同月龄相对表达量数据，SPSS 17.0软件分析表达量差异。结果表明：MSTN基因在1～6月龄哈萨克羔羊尾脂中的相对表达量6月龄最高，1、2、3、4各月龄之间无显著性差异（P＞0.05），5月龄最低。说明MSTN基因在脂肪中的表达量在生长发育的前期差异不显著（P＞0.05），在5月龄显著降到最低点，随后在6月龄达到最高。

MSTN基因；哈萨克羊羔羊；表达量

哈萨克羊是新疆古老的优良地方肉脂兼用型绵羊品种，长期游牧于天山、阿勒泰山及准噶尔盆地边缘，为中国三大粗毛羊品种之一［1］，曾是新疆数量最多、分布最广的绵羊品种［2］。哈萨克羊耐寒、耐粗饲，抗病性强，对自然牧区生态条件有较强的适应性，现已成为适应牧区放牧的良好肉脂兼用型粗毛羊品种，具有很高的经济价值。MSTN又称生长分化因子GDF-8，是转化生长因子（TGF-β）超家族中的一员，对肌肉的生长起着至关重要的负调控作用，1997年由Mcpherron科研小组首次发现，由于其对肌肉生长起负调控作用被命名为生长抑制素基因。近期研究发现，MSTN（生长抑制素）基因可加强脂前体细胞和脂源性干细胞生成的过程，也可对脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化起抑制作用［3］，MSTN基因分泌过多会导致脂分解加强，缺失会影响脂肪形成［4］。Artaza等对小鼠注射MSTN基因重组和抗MSTN抗体，研究胚胎成纤维细胞间充质干细胞系成脂成肌分化的作用，结果表明，MSTN基因可削弱成纤维细胞的成纤分化作用，加强成纤维细胞向脂肪分化的作用［5］。McPherron等［6］研究发现，在保持正常的采食量、体温及略低代谢速率的条件下，MSTN基因缺失的小鼠随着年龄的增加，脂肪积累量显著降低。目前虽然对MSTN基因的研究有一定的进展，但MSTN基因在脂肪中的表达水平发育性变化的相关文献甚少。本文以新疆地方良种绵羊品种哈萨克羔羊为研究对象，探索MSTN基因在其脂肪中的表达规律，不仅可为MSTN基因在脂肪中的表达规律提供科学的遗传学资料，也可结合实际，对哈萨克羊的良种保留与繁育以及肉品质的改善提供很好的指导意义。

1 材料与方法

1.1 动物

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂（Trizol Reagent）、反转录试剂（Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-、Ribonuclease Inhibitor、10×mmol/L dNTP Mixture、5×RT buffer）、荧光定量试剂（Ribonuclease Inhibitor、SYBR PremixExTaqTM、 ROX）均购自TaKaRa公司，琼脂糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC（焦磷酸二乙酯）均购自新疆阜瑞科生物科技有限公司。TGL-16高速台式冷冻低温离心机：湘仪试验室仪器开发有限公司，DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂，普通Biometerya PCR仪：北京艾思普科技有限公司，Gel Doc 2000型凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司，荧光定量Biometerya PCR仪：北京艾思普科技有限公司。

1.3 引物设计及合成

根据各基因在GenBank上的mRNA序列（MSTN为NM-001009428.1，β-Actin为 U39357），利用 Primer premier 5.0引物设计软件设计引物，上海生工生物公司合成后使用灭菌超纯水处理，溶解稀释成10 μmol/L，-20℃保存。各基因的引物序列见表1。

表1 引物序列参数

1.4 基因组总RNA的提取与cDNA的合成

按照Trizol说明进行提取，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳，检测总RNA的完整性，检测合格的RNA保存于超低温冰箱中（-80℃）中。反转录加样体系（20 μL）：模板RNA 2.5 μg，OligodT（18）primer 1 μL，RNase Free ddH2O补至12 μL；在普通PCR仪上65℃保温5 min；迅速急冷2 min以上，离心5 s；加5×Reaction Buffer 4 μL，10×dNTP 1 μL，Revert Aid M-MuLV RT（200 U/μL）1 μL，Ribo Lock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL；普通PCR仪上 42℃，60 min，70℃，5 min。

RNA反转录为cDNA后，加RNaseFreeddH2O80μL，得到浓度为25 ng/μL的cDNA模板，进行荧光定量PCR试验。

1.5 PCR扩增

以反转录产物为模板进行普通PCR反应。PCR反应体系25 μL：PCR×2×Master 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNase-free ddH2O 9.5 μL。反应条件：预变性94℃5 min，变性94℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循环34个，延伸72℃5 min，永久4℃。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收。

1.6 定量

普通PCR扩增检测引物特异性后，对cDNA进行荧光定量。20 μL荧光定量扩增（PCR）反应体系加样：2×SYBR Premix EX Taq 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL（10 μmol/L），RNasefree ddH2O 7 μL，离心3 s，放入荧光定量PCR仪进行扩增（扩增程序：95℃变性30 s，61℃退火30 s，38个循环，熔解曲线：95～60℃0.5℃/min，降温：50℃3 min），实时观测扩增情况。

1.7 统计与分析

实时荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，SPSS统计软件17.0单样本方差分析相对表达量，数据结果以平均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量检测

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA，从图1中可见较清晰的RNA条带：28 S、18 S和5.8 S，其中5.8 S带较浅，说明RNA质量好。D260/D280比值在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较好，可以继续后续的试验。

2.2 普通PCR扩增目的基因

采用2%琼脂糖凝胶电泳检测MSTN基因扩增产物的质量，结果见图2。从图2可以看出，目的基因PCR扩增片段为175 bp左右（参照Mark为1 000），由此可见引物可靠，可以做定量分析。

图1 RNA的琼脂糖电泳检测结果

图2 MSTN基因PCR扩增结果

2.3 荧光定量PCR结果与分析

2.3.1 荧光定量PCR熔解曲线 通过熔解曲线可以看出，使用引物PCR产物均呈单一峰（图3），可以排除引物二聚体或其他因素的干扰，说明引物有较好的特异性。

2.3.2 MSTN基因在1～6月龄哈萨克羊尾脂中的相对表达量 从图4可知，MSTN在6月龄羔羊尾脂中的相对表达量最高，显著高于1、3、4、5月龄羔羊（P＜0.05）。而1、2、3、4月龄相对表达量间无显著性差异（P＞0.05）。5月龄的相对表达量最低，且显著低于2月龄和6月龄的相对表达量（P＜0.05），但与其他各月龄间差异不显著（P＞0.05）。

图3 MSTN基因的熔解曲线

图4 MSTN基因在1～6月龄羔羊尾脂中的相对表达量

3 讨论

MSTN由于其对肌肉生长的负显著调控作用，在肌肉组织中的定量研究较多［7-12］，而在脂肪中的研究较少。Hira等［13］利用MSTN处理牛前脂肪细胞发现，MSTN能抑制脂肪细胞的分化。吐来力江［14］研究发现，脂肪组织中MSTN基因mRNA表达量随月龄增加逐渐上升。祖玲玲等［15］研究发现，MSTN在0～6月龄新疆也勒白羊脂肪中的表达量随月龄增长而升高，在5月龄达到最高，而后降低。而在本研究中，MSTN在1～6月龄哈萨克羔羊尾脂中的表达量没有随月龄增长而有升高趋势，1、2、3、4月龄之间的相对表达量无显著性差异（P＞0.05），在5月龄降到最低，6月龄达到最高，分析原因可能存在品种差异、试验偶然性等。MSTN基因在不同品种羊脂肪中是否存在一致的表达规律，还需加大样本进一步研究。

4 结论

MSTN基因在哈萨克羔羊脂肪中的表达水平在生长发育的前期差异不显著（P＞0.05），在5月龄时显著降到最低，6月龄达到最高。

［1］ 赵有璋.羊生产学［M］.2版.北京：中国农业出版社，2002：70-140.

［2］ 新疆维吾尔自治区地方志编纂委员会.新疆通志·畜牧志［M］.乌鲁木齐：新疆人民出版社，1996.

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［4］ Kim H S，Liang L，Dean R G，et al.Inhibition of preadipocyte differentiation by myostatin treatment in 3T3-L1 cultures［J］.Biochem BiophysResCommun，2001，281（4）：902-906.

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［8］ 梁婧娴，陈志成.藏系绵羊MSTN基因在不同年龄不同组织的表达定量研究［J］.安徽农业科学，2011，39（17）：10454-10457.

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［13］Hirai S，MatsumotoH，HinoN，et al.Myostatin inhibits differentiation ofbovine preadipocyte［J］.Domest AnimEndoerinol，2007，32：l-14.

［14］吐来力江.MSTN/Smad信号通路与阿勒泰羊肌肉生长发育、产肉性能关联性的研究［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2014.

［15］祖玲玲，吐来力江·哈姆太，决肯·阿尼瓦什，等.新疆也木勒白羊MSTN基因不同生长时期表达量的定量研究［J］.中国畜牧兽医，2014，41（12）：98-101.

Expression of MSTN Gene in Fat Tissues of Kazak Lambs during 1-6 Months

Zu Lingling，YaoLidan，Jueken·Aniwashi，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

To inverstigate the expression of MSTN gene in fat tissue of Kazak lambs during the age of 1-6 months，the fat tissues in the buttocks were sampled and analyzed by using quantitavive PCR.The results showed that the relative expression level of MSTN gene was the highest at the age of6 month，the lowest at the age of5 month and nosignificant differences amongthe ages of 1，2，3，4 month（P＞0.05）.

MSTN gene；Kazak lamb；expression

S826.2

A

2095-3887（2016）02-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.002

2015-12-18

国家自然科学基金（31260530）

祖玲玲（1988-），女，硕士研究生。

决肯·阿尼瓦什（1962-），男，教授，博士。研究方向：动物遗传育种与繁殖。