NOD/SCID雌性小鼠动情周期的观察

甄玉花，宋阳*，关永格，李坤寅，胡光云，廖慧慧

(1. 广州中医药大学，广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)



NOD/SCID雌性小鼠动情周期的观察

甄玉花1，宋阳1*，关永格2，李坤寅1，胡光云1，廖慧慧2

(1. 广州中医药大学，广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

目的 观察NOD/SCID小鼠动情周期及卵巢切除术后阴道涂片的变化。方法 连续观察9 d NOD/SCID鼠，每日进行两次阴道涂片，计算动情周期时间及发生率。卵巢切除后，阴道涂片并观察阴道涂片变化。结果 NOD/SCID小鼠动情周期为4～6 d。有规律动情的小鼠占80%。阴道口状态与动情周期无明显相关。卵巢切除术后，阴道涂片呈动情后期或动情间期改变。结论 采用阴道脱落细胞涂片法可判断NOD/SCID雌性小鼠的动情周期及特点，NOD/SCID雌性小鼠卵巢切除手术有效。

NOD/SCID小鼠；动情周期；阴道涂片；卵巢切除术

非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠是非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交而成的免疫缺陷小鼠[1]，该小鼠除了具有先天缺陷的特点，还缺乏T细胞、B细胞和NK细胞，免疫渗漏不到10%，目前广泛应用于糖尿病、白血病、肿瘤等疾病的研究[2, 3]。目前已经有文献报道关于KM小鼠、ICR小鼠等动情周期情况，NOD/SCID雌性小鼠动情周期特点尚未有文献报道。对于小鼠动情周期的判断，文献报道有宫颈粘液结晶法、阴道脱落细胞法、角化细胞计数法几种[4]。本研究主要采用阴道脱落细胞法研究NOD/SCID小鼠的动情周期及卵巢去势后阴道涂片变化，为今后利用该品系生物医学方面的研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雌性SPF级NOD/SCID小鼠15只，6周龄，体重17.9～20.4 g，平均(19.4±0.63)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】。适应性饲养一周，每笼5只，温度26℃，湿度60%～70%，12 h明暗交替，实验期间自由饮用蒸馏水。实验在广州中医药大学实验动物中心的SPF级实验室内进行【SYXK(粤)2013-0001】。

1.1.2 器材和试剂

光学倒置显微镜(Olympus IX-71，日本)，显微镜载玻片(江苏世泰实验器材有限公司，中国)，1%亚甲基蓝染色液(北京雷根生物技术有限公司，中国)，氢氧化钾(天津市瑞金特化学品有限公司，中国)，水合氯醛(Ceres Chemical)，氨基甲酸乙酯(Maya Reagent)，多聚甲醛(北京雷根生物技术有限公司，中国)，生理盐水(贵州天地药业有限责任公司，中国)。1.2 方法

1.2.1 阴道涂片

第1～9天阴道涂片，每日2次(8:00-9:00，16:00-17:00)。进行阴道涂片前，将阴道口状态进行记录。用拇指和食指固定小鼠背部皮肤，将小鼠握于掌心，无名指和小指固定尾根，暴露阴道口。用沾有生理盐水的细轴棉棒缓慢插入小鼠阴道，轻轻旋转一周，将棉棒抽出，将粘液均匀涂抹在载玻片上。玻片晾干后，用4%的多聚甲醛固定30 min。

1.2.2 卵巢切除术

第10天行卵巢切除术，过程如下：以水合氯醛(5%)+氨基甲酸乙酯(10%)腹腔注射麻醉，俯卧位，固定双后肢。从后肢前缘1 cm正中处做一长约1 cm横切口，正中线左侧旁开1 cm逐层钝性分离，进入腹腔，眼科镊轻夹白色脂肪团，缓慢拉出切口外，轻轻分离脂肪团，可见到鲜红色或淡红色椭圆形小米粒大小卵巢组织。眼科镊钝性分离穿过子宫角下方组织，注意避开血管，3-0丝线结扎子宫角处，再结扎卵巢周围脂肪，眼科剪摘除卵巢，将脂肪垫和子宫送回腹腔。同法处理右侧卵巢，缝合皮肤。术后每日阴道涂片2次，持续7 d。

1.2.3 美兰染色液的配制

亚甲蓝溶液(1%)60 mL，加入95%乙醇30 mL，加入0.01 g KOH，加蒸馏水10 mL，混合均匀。

1.2.4 阴道涂片染色

将固定后的阴道涂片载玻片放在玻片架上，放入美兰染色液中进行染色，10 min后，取出载玻片，用蒸馏水冲洗玻片缓慢冲洗边缘，晾干后，显微镜观察(左，×40，右×200)，拍照。

2 结果

2.1 NOD/SCID小鼠动情周期情况

大量文献资料总结[5]，采用阴道脱落细胞法，小鼠不同动情周期阴道涂片的变化如下：动情前期，大量椭圆形有核上皮细胞少量白细胞(图1A,B)；动情期，大量无核角化上皮细胞(图1C,D)；动情后期，无核角化上皮细胞、椭圆形有核细胞、白细胞同时存在(图1E,F)；动情间期：大量白细胞，少量有核上皮细胞(图1G,H)。据此，判断NOD/SCID小鼠的各个动情阶段的阴道涂片。NOD/SCID小鼠动情周期为4～6 d，6只鼠观察到1次动情，占40%；6只鼠观察到2次动情，占40%。小鼠发生规律动情的有12只，占80%。在动情期持续时间方面，由于本实验每日进行两次阴道涂片，每日两次均见到动情期变化的有4次，时间大约7～8 h左右。见图1。

2.2 NOD/SCID小鼠外阴变化

文献报道[6]，ICR小鼠随动情周期变化，阴门口颜色呈明显变化，动情期阴门口为红色，皱襞明显肿胀。NOD/SCID小鼠阴门口颜色一般呈粉色，未见明显阴门皱襞变化，阴道口呈现开或闭合的状态。将阴道口状态与动情周期进行对比，赋值如下：阴道口闭合为0，张开为1；动情间期为0，动情前期为1，动情期为2，动情后期为3。进行Spearman相关分析，P=0.085，二者无明显相关。

2.3 卵巢切除术后阴道涂片变化

卵巢切除术后1～3 d，阴道涂片呈动情后期或动情间期状态。卵巢切除术后3 d：大量白细胞，少量有核上皮细胞(图I,J)。卵巢切除术后3～7 d，阴道涂片呈连续动情间期状态。以此证明，卵巢切除手术有效。

3 讨论

本实验系统研究N0D/SCID雌性小鼠的动情周期，并且观察卵巢切除术后的阴道涂片。文献指出[6]，手术应激对小鼠动情周期的时间、各期持续时间无明显影响，且NOD/SCID小鼠价格昂贵，故本实验未专门设立正常对照组和假手术组。

NOD/SCID小鼠2～3周龄离乳，6～7周龄达到性成熟，一般选用6～8周龄用于实验研究。本实验研究结果显示，NOD/SCID小鼠6周龄，17.9～20.4 g，动情周期为4～6 d，波动范围相对较大，80%小鼠有规律动情周期。卵巢切除术后1～2 d，由于小鼠体内残留的雌激素作用，小鼠阴道涂片出现动情后期状态。随时间推移，体内残留雌激素代谢以后，阴道涂片呈连续动情间期状态。采用阴道脱落细胞法进行动态观察，可有效判断NOD/SCID小鼠的的动情周期。在受孕实验中，将处于动情前期或动情期的雌鼠交配，可有效提高受孕率[7]。

注：A，B：动情前期；C，D：动情期；E，F：动情后期；G，H：动情间期；I，J：卵巢切除术后。(左侧×40，比例尺：×200 μm;右侧×200，比例尺：×40 μm)。图1 NOD/SCID小鼠不同动情周期阴道涂片Note. A,B: Preoestrus stage.C,D: Estrus stage. E,F: Metestrus stage. G,H: Diestrus stage. I,J: After ovariectomy.Fig.1 Vaginal smears of the NOD/SCID mice at different stages of estrous cycle.(left panel:×40;Right panel:×200)

未经染色时，阴道涂片可见结晶，固定染色后，结晶消失。动情前期，可见到云雾状结晶。动情期，未见到典型结晶。动情后期及动情间期的阴道涂片，除了见到细胞形态外，还可见到大量金鱼草样结晶，考虑是由于粘液导致的。这与人类排卵期出现的羊齿状结晶不同，仅凭看到规则结晶，尚不能确定NOD/SCID小鼠处于动情期，这与文献报道一致[4]。对于无规律动情期的NOD/SCID小鼠，非动情期也可出现羊齿状结晶，这一特点和普通KM小鼠有相似之处[4]。卵巢切除术后3～7 d的阴道涂片，除了少量有核上皮细胞，大量白细胞，亦可见到大量规则金鱼草状结晶，这与排卵与否无关。

在本实验中，动情周期阴道口状态与动情周期无明显相关，通过阴道口无法判断NOD/SCID小鼠处于动情周期的哪一个阶段，这与相关研究一致[6]。在36只SD大鼠的研究中，15只动情期大鼠外阴出现肿胀，相符率达到42%[7]。而本研究中，阴道口呈张开状态的NOD/SCID小鼠不一定处于动情期，还可能是动情后期、动情间期。有2只NOD/SCID小鼠在动情期出现阴道口湿润，分泌物清稀。

一般在观察动物动情期持续时间时，需要严格按照每隔几小时进行一次阴道涂片。本实验由于受实验室条件限制，每日进行阴道涂片两次，具体动情期持续时间无法严格判断。

在本实验中，卵巢切除术后进行连续阴道涂片，可确认卵巢去势是否成功。去卵巢NOD/SCID小鼠在国外文献中应用较多，一般配合补充雌孕激素缓释片，用于建立移植异体子宫肌瘤的模型[8]。

[1] Fiebitz A, Fritsch M, Reichelt U, et al. Optimized culture conditions for tissue explants of uterine leiomyoma[J]. ClinLab,2012,58:1153-1164.

[2] 张欣，于亮. NOD/SCID小鼠-白血病模型在白血病研究中的应用现状及进展[J]. 临床血液学杂志,2015, 28(03):451-454.

[3] Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice[J]. J Immunol,1995,154(1):180-191.

[4] 李靖，李炫诚，吴云霞. 确定小鼠动情周期的三种方法[J]. 实验动物科学,2007, 24(03):63-64.

[5] 孙艳浮，李瑞玉. 中医药治疗子宫肌瘤的现状及展望[J]. 中国民间疗法,2015, 23(09):96-97.

[6] 杜纳纳，许丹丹，黄莉莉. 去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠动情周期的观察[J]. 中国病理生理杂志,2015, 31(12):2301-2304.

[7] 肖尚杰，慧敏，秋明. 大鼠阴道涂片的观察[J]. 广州医学院学报,2007,35(4):54-56.

[8] Wang G, Ishikawa H, Sone K, et al. Nonobese diabetic/severe combined immunodeficient murine xenograft model for human uterine leiomyoma[J]. Fertil Steril,2014,101(5):1485-1492.

Observation of the estrous cycle in female NOD/SCID mice

ZHEN Yu-hua1, SONG Yang1*, GUAN Yong-ge2, LI Kun-yin1, Hu Guang-yun1, LIAO Hui-hui2

(1. Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405, China;2.The First Affiliated Hospital,Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405)

Objective To observe the changes in estrous cycle and vaginal smears in ovarectomized NOD/SCID mice.Methods To continuously observe the estrous cycle time by vaginal smears of NOD/SCID mice in consecutive nine days, twice daily. After ovariectomy, the changes of estrous cycle were observed by vaginal smears for 7 days.Results The estrous cycle in NOD/SCID mice was 4-6 days. Regular estrous mice accounted for 80%. There was no significant correlation between vaginal opening and estrous cycle status. After ovariectomy, the vaginal smears showed characteristics of metestrus or diestrus. Conclusions Vaginal smear cytology can be used to determine the estrous cycle and characteristics of NOD/SCID female mice.The ovariectomized operation of NOD/SCID female mice is effective.

NOD / SCID mice; Estrous cycle; Vaginal smear;Ovariectomy

SONG Yang.E-mail: fau20@126.com

广东省自然科学基金(2014A030313401)。

甄玉花(1987-)，女，博士研究生，主要从事补肾活血法治疗妇科肿瘤及月经病的研究。Email: drzhenyuhua@163.com

宋阳，男，博士，教授，主要从事促进女性生殖健康等方面的研究. Email: fau20@126.com

研究报告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0526-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.016

2016-05-11