大鼠中枢神经系统中神经肽S的表达及对睡眠功能的影响

叶建新 林 航 穆军山 崔晓萍

南京军区福州总医院神经内科 福建医科大学福建总医院临床医学院 福州 350025



·论著·

大鼠中枢神经系统中神经肽S的表达及对睡眠功能的影响

叶建新 林 航 穆军山 崔晓萍

南京军区福州总医院神经内科 福建医科大学福建总医院临床医学院 福州 350025

目的 研究剥夺睡眠大鼠的神经肽S表达水平，探讨其与睡眠的关系。方法 共对27只大鼠进行实验，分别为CC组(正常对照组)、TC组(环境对照组)及SD组(睡眠对照组)，在相应的环境中饲养1 d、3 d和5 d，对大鼠下丘脑中神经肽S的表达水平进行研究并比较。结果 大鼠睡眠剥夺后出现体质量降低、皮毛蓬乱、潮湿无光滑。部分大鼠尾巴和爪子出现磨损，大鼠情绪烦躁不安，较容易发怒且具有较强的攻击性，这些表现在睡眠剥夺5 d后表现得更加明显；CC组和TC组在实验第1天、第3天和第5天的下丘脑神经肽S mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；SD组第3天和第5天下丘脑神经肽S mRNA的表达水平均高于第1天，差异具有统计学意义(P<0.05)；SD组第3天和第5天下丘脑神经肽S mRNA的表达水平均高于CC组和TC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 神经肽S可能具有促进觉醒的作用，对人体的睡眠与觉醒产生一定的调节作用，可能与失眠等多种疾病的发生具有密切的相关性，值得更加深入的研究。

睡眠剥夺；神经肽S；睡眠

人们在日常生活中约1/3的时间在睡眠当中，睡眠过程中人体也在进行着各种重要的生理活动[1]。但是也会由于各种原因而引起睡眠丢失的状态，称为睡眠剥夺，如果患者仅仅是部分的睡眠剥夺也被称为睡眠不足[2]。随着人们工作压力的不断增加和生活节奏的加快，睡眠剥夺已经影响到人们的生活[3]。睡眠和觉醒是一个非常复杂的过程，涉及到许多复杂的神经环路和多种神经化学物质。研究表明，在脑室注射了神经肽S以后，小鼠的空间记忆能力明显的增强，但神经肽S对睡眠剥夺所引起的认知功能损害是否会产生一定的作用，并没有明确的研究[4]。本文对大鼠中枢神经系统中神经肽S的表达对睡眠的影响进行了详细研究，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 实验动物 本次研究所采用的实验动物为14～16周龄的SD大鼠，所有大鼠的体质量220～250 g，大鼠饲养在动物睡眠实验室中，保持室内12 h进行灯的明暗自动切换。大鼠可以自由进行水和食物的摄取，室内的相对湿度在40%～70%，温度保持在22～24 ℃。

1．2 实验方法

1．2．1 实验动物分组：共对27只大鼠进行实验，对所有的大鼠进行编号，并用苦味酸进行标记，分别称质量。将所有的大鼠随机分为3组，每组各9只，分别为CC组(正常对照组)、TC组(环境对照组)以及SD组(睡眠对照组)，各组内再对大鼠按照时间进行分组，分别为第1天、第2天和第3天，每个小分组中各有3只大鼠。

1．2．2 睡眠剥夺模型的建立：对大鼠采用改良的多平台睡眠剥夺法进行睡眠剥夺模型的建立。SD组：在水槽内加入温度保持在22～24 ℃的水，水槽的顶部有充足的食物和水供大鼠摄入。在水中放10个直径为6.5 cm的平台，大鼠可以在水槽中自由活动。但是大鼠在平台上入睡的时候会由于身体失衡触碰睡眠而导致惊醒，从而被剥夺了睡眠。TC组：水平放入直径约为12.5 cm的大平台，大鼠可以在平台上入睡。CC组：CC组的大鼠与之前的饲养环境相同，仍然在睡眠实验室中进行饲养。

1．2．3 下丘脑神经肽S mRNA的表达水平的检测：①总RNA的提取：取出大鼠的下丘脑组织进行称质量，记录质量后放入玻璃研磨器中进行研磨，然后按照称质量的比例加入一定量的Trizol溶液在室温的条件下放置15 min，进行预处理。然后再加入氯仿(0.2 mL/1 mL Trizol)静置5 min后进行离心。再加入0.5 mL异丙醇静置10 min后离心进行沉淀。然后对沉淀物采用75%的乙醇溶液进行洗脱。②逆转录：取出4 μL的RNA提取物，加入随机引物、DEPC等溶液在65 ℃的条件下进行5 min的孵育，然后加入反转录的缓冲液，加热到80 ℃，加入反转录酶后在冰上冷却，终止反应。③PCR反应：设计引物→预变性→变性→退火→延伸，共进行30个循环。④琼脂糖凝胶电泳：将PCR反应的产物放入到1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，然后溴化乙锭进行染色，采用照相用的计算机凸显分析仪对PCR的反应产物进行定量分析。

2 结果

2．1 睡眠剥夺后大鼠的行为变化 大鼠进行睡眠剥夺后出现体质量降低、皮毛蓬乱、潮湿无光滑。部分大鼠的尾巴和爪子出现磨损，大鼠的情绪烦躁不安，较容易发怒且具有较强的攻击性，这些表现在睡眠剥夺5 d后表现得更加明显。

2．2 大鼠下丘脑神经肽S mRNA表达水平的变化 使用RT-OCR的方法对下丘脑神经肽S mRNA的表达水平进行定量检测。CC组和TC组在实验的第1天、第3天和第5天的下丘脑神经肽S mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；SD组第3天和第5天下丘脑神经肽S mRNA的表达水平均高于第1天，差异具有统计学意义(P<0.05)；SD组第3天和第5天下丘脑神经肽S mRNA的表达水平均高于CC组和TC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 下丘脑神经肽S mRNA表达

组别第1天第3天第5天CC2639±0892525±1262569±171TC2618±0592426±1262589±096SD2732±0695326±136abc5236±126abc

注：SD组第3天和第5天的表达水平与第1天比较，aP<0.05；SD组第2天的表达水平与CC组比较，bP<0.05；SD组第5天与TC组的表达水平比较，cP<0.05

3 讨论

本文所采用的睡眠剥夺方式是较常用的睡眠剥夺方式，多平台的方式克服了单平台剥夺法对大鼠活动的阻碍等缺点，减少了诸多应激因素对剥夺结果的干扰[5]。从本次研究的结果可以看出，多平台睡眠剥夺的方式的确可以有效对大鼠进行睡眠剥夺，睡眠剥夺的大鼠多表现出情绪上的暴躁、易怒和攻击性，体征上的体质量减小、皮毛质量下降等各种特点，也说明了睡眠剥夺的确会对身体产生不良的影响[6]。

睡眠和觉醒是一个较复杂的神经反应的过程，很多神经递质都参与了这个过程，如乙酰胆碱、谷氨酸等[7]。近几年，很多神经肽类的物质被发现，学者们初步认为这些神经肽类与人体的睡眠和觉醒的关系十分密切。神经肽S是最新报道的一种参与人体睡眠调节的神经肽类[8]。有学者[9]对小鼠进行了研究，注射神经肽S 0.1 nmol可以使得小鼠1 d的觉醒时间增加到69%，如果提高神经肽S的剂量到1.0 nmol，相应的小鼠1 d的觉醒时间高达87%，与正常注射生理盐水的小鼠相比觉醒时间占比明显增加[10]。对小鼠的睡眠进行检测，发现小鼠的慢波睡眠和动眼睡眠与注射生理盐水的小鼠相比明显减少[11]。充分说明了神经肽S能够在睡眠的过程中发挥促进唤醒的作用，而且对慢波睡眠和动眼睡眠都能够发挥作用。注射神经肽S后1 h之内就会发生作用[12]。也有研究表明，神经肽orexinA也具有促觉醒的作用，orexin对去甲肾上腺素产生刺激作用，然后激活单胺能系统从而起到促觉醒的作用[13]。也有学者[14]对神经肽S的作用机制进行了研究，对失眠的患者进行基因型的检测，发现神经肽S的基因突变可能会产生睡眠障碍，因此神经肽SR的蛋白配体可能是一种促进睡眠的因子，而神经肽S则可能促进觉醒，因此，神经肽S的作用机制很可能是直接作用于脑内的睡眠系统[15]。

从本次研究的结果中可以发现，剥夺睡眠后的大鼠体内的神经肽S表达量明显升高，也充分说明了神经肽S可能具有促进觉醒的作用。神经肽S是由下丘脑产生的，下丘脑分泌神经肽S后可以作用于腺垂体，产生一定的刺激作用，而神经肽S的表达水平越高，这种刺激作用就越强烈，从而促觉醒的作用也越强烈。关于神经肽S对睡眠的调节作用的机制可以进行更加深入的研究。

综上所述，神经肽S可能具有促进觉醒的作用，对人体的睡眠与觉醒产生一定的调节作用，可能与失眠等多种疾病的发生具有密切的相关性，值得进行更加深入的研究。

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(收稿2016-03-11)

The effect of expression level of neuropeptide S in central nervous system on sleep function in rats

Ye Jianxin，Lin Hang，Mu Junshan，Cui Xiaoping

Department of Neurology，the Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region，Fuzhou 350025，China

Objective To investigate the relationship between the expression of neuropeptide S deprived from rats and sleep．Methods A total of 27 rats were divided into CC group(normal-control group)，TC group(environmental-control group) and SD group(sleepful-control group)．The expression level of neuropeptide S in hypothalamus was tested and compared after raising all rats for one，three and five days．Results Weight loss and no smooth，wet unkempt fur happened after sleep deprivation in rats．The tails and claws of some rats were worn-off，and the rats were prone to be angry and aggressive，all of which were more obvious on the fifth day after sleep deprivation．On the first，third and fifth days，no statistical differences were found between CC group and TC group as for the expression levels of neuropeptide S mRNA in hypothalamus(P>0.05)，however the expression levels in SD group on the third and fifth days were significantly higher than those on the first day(P<0.05) and in CC group and TC group(P<0.05)．Conclusion Neuropeptide S may play a role in promoting human bodies’ awakening and have a certain regulating effect on sleep and awakening，which may be related to many diseases such as insomnia and should be further studied．

Sleep deprivation；Neuropeptide S；Sleep

南京军区医学科技创新课题(编号：MS130)

R743.33

A

1673-5110(2016)21-0001-02