131I-c（RGD）2的药代动力学及急性毒性研究

马 欢，郝 攀，马 超，闫 平，刘 敏，王荣福，陈雪祺，张春丽

（1.北京大学第一医院核医学科，北京 100034；2.厦门大学附属中山医院核医学科，福建 厦门 361004）

·基础研究·

131I-c（RGD）2的药代动力学及急性毒性研究

马 欢1，郝 攀1，马 超2，闫 平1，刘 敏1，王荣福1，陈雪祺1，张春丽1

（1.北京大学第一医院核医学科，北京 100034；2.厦门大学附属中山医院核医学科，福建 厦门 361004）

目的 用131I标记二硫键成环的 RGD肽二聚体 c（RGD）2，探讨其在裸鼠体内的药代动力学参数、急性毒性反应和死亡情况，评价其应用的安全性。方法 选取5只裸鼠为实验对象，每只经尾静脉注射131I-c（RGD）2（7.4 MBq／200 μL），分别于注射后3、6、10、15、30、45、60、120、180及360min断尾取血5 μL，测量血液的放射性计数，采用PKSolver软件进行药代动力学分析。另取裸鼠10只随机分为实验组及对照组，实验组每只经尾静脉注射131I-c（RGD）2（7.4 MB／60μL）；对照组经尾静脉注射生理盐水60μL，观察注射后72 h内裸鼠的不良反应和死亡情况。结果 血液药-时曲线符合权重系数为1／CC的开放性二房室分布模型，其中分布相半衰期（t1／2α）为15.364 min，消除相半衰期（t1／2β）为123.125 min。注射131I-c（RGD）2后72 h内，裸鼠无不良反应与死亡。结论 c（RGD）2具有理想的药代动力学特点，且无明显毒性作用，这些均有利于其作为新药应用于临床。

药代动力学； RGD肽； 急性毒性

RGD是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的多肽，在生物体内广泛存在，它是整合素及其配体作用的识别位点，介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质之间的黏附作用，并且具有信号传导的功能［1-3］。整合素 αvβ3受体在肿瘤新生血管内皮细胞表面高度表达，而含 RGD序列的多肽可特异性地与αvβ3受体结合，放射性核素标记的含 RGD序列的多肽已应用于肿瘤血管生成显像研究［4］。

目前研究较多的 RGD肽多为酰胺键成环的环肽及其多聚体，其环化过程困难，而二硫键成环的RGD肽合成相对容易。在前期研究中，我们通过 V-life软件分子对接程序筛选出了二硫键成环的新型RGD二聚体肽c（RGD）2［5］，制备合成了具有高放化纯度的131I-c（RGD）2，并且在活体动物显像中获得了高质量的影像［6］，表明该新型多肽有应用于临床肿瘤显像的潜在价值。作为新药用于临床显像，不仅要求 c（RGD）2在靶组织中具有较高的摄取率，而且要具有适合于诊断的药代动力学性质。

本文采用放射性核素131I标记 c（RGD）2，研究131I-c（RGD）2在裸鼠体内的药代动力学特征及急性毒性反应，获取体内半衰期等主要药代动力学参数，为其作为新药在临床中的应用提供理论依据。

材料和方法

1 主要材料

Na131I溶液由中国原子能科学研究院同位素所提供；氯胺-T（ChT）：上海国药集团化学试剂有限公司产品，纯度＞98%；Sephadex TM G10：Amersham Bioscience（AB公司）产品。层析纸为新华 1号滤纸。BALB／c裸鼠15只（雌性，体重20～22g，4～6周龄）由北京大学医学部实验动物科学部提供，符合实验动物质量标准。

2 方法

2.1131I-（RGD）2的制备与纯化 采用ChT法标记c（RGD）2，将50 μg c（RGD）2溶于100 μL pH 7.4的0.5 mmol／L的磷酸盐缓冲液中，然后向上述反应液中加入 10 μL Na131I溶液，同时加入 ChT溶液，使ChT的终浓度为 10 μg／μL，总反应体积不超过 200 μL，室温下震荡反应2 min，立即将标记物经Sephadex G10柱层析分离纯化，用pH 7.4的0.05 mmol／L磷酸盐缓冲液冲洗，收集淋洗液1 mL／管，测定每管的放射性计数。第一个计数峰值管为131I-c（RGD）2，采用纸层析法测定标记率与放化纯度，展开剂为正丁醇∶无水乙醇∶0.5mol／L氨水 ＝5∶1∶2（V∶V∶V），Rf为0～0.1。最终产品的放化纯度≥90%。

2.2 最佳房室模型分析与药代动力学参数计算 取 5只裸鼠，分别经尾静脉注射 7.4 MBq131I-c（RGD）2，于注射后 3、6、10、15、30、45、60、120、180及360 min经断尾取血5 μL，测定血液样品的放射性计数，并换算为血液放射性浓度（即kBq／mL）。应用药代动力学软件PKSolver，将软件中药物浓度用血液放射性浓度替换，对 5只裸鼠的平均血液放射性浓度-时间数据进行分析，分别用一、二、三室模型进行消除曲线拟合，同时将 1、1／C、1／CC作为权重系数（C为血液的放射性浓度），AUC、AUMC、MRT采用统计矩参数，遵循最小信息准则（Akaike information criterion，AIC）最小原则，得出最佳房室模型，求得各有关体内代谢动力学方程系数及代谢动力学参数。

2.3 急性毒性试验 取裸鼠 10只，随机分为实验组及对照组，每组5只，实验组每只裸鼠经尾静脉注射131I-c（RGD）2溶液 7.4 MBq／60 μL；对照组每只裸鼠经尾静脉注射生理盐水 60 μL。给药后 72 h内观察裸鼠的中枢神经系统症状、活动行为、粪便、体重变化及死亡等情况。

3 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 最佳房室模型及药代动力学参数

利用 PKSolver软件绘制出平均血液放射性浓度-时间曲线（图 1），并得出不同模型各权重下的AIC及拟合度（R2）值（表1）。可见131I-c（RGD）2在裸鼠体内的最佳药代动力学房室模型为权重1／CC的二室模型。经拟合得到血液放射性浓度-时间关系式为：

C（t）＝9245.084e-0.045t＋2278.969e-0.006t

其中，公式中C为血液放射性浓度（kBq／mL），t为注射标记物后的时间（min）。标记物在裸鼠体内的药代动力学参数见表2。

表1 不同权重数下各室模型的 AIC值和 R2

表2 标记物131I-c（RGD）2在裸鼠体内的药代动力学参数

2 急性毒性试验结果

注射131I-c（RGD）2后72 h内，裸鼠未出现步伐不稳、抽搐、呼吸困难、后肢强直及死亡等不良现象。实验组裸鼠注射131I-c（RGD）2后，体重未发生明显改变，且饮水量与对照组裸鼠无差别。

讨 论

药代动力学研究是新药临床前研究的重要组成部分，通过对新药的动物和人体药代动力学研究，明确药物吸收、分布、代谢和排泄的特征，寻找药物在体内的处置过程和转运规律，药物在体内的积蓄速度和积蓄程度，为临床安全合理用药提供依据。

药代动力学研究显示，多肽 c（RGD）2在裸鼠体内符合权重系数为1／CC的二室模型，与αvβ3受体在正常组织中极低表达或不表达的结论相符［7］。药代动力学参数中，反映药物自血液向组织液分布快慢的α值（0.045）是代表体内药物消除速率β值（0.006）的 7.5倍。分布相半衰期（t1／2α）表示药物在血液中的浓度达到最大值的一半所需要的时间，代表药物吸收的快慢。t1／2α为15.364 min，说明131I-c（RGD）2吸收快，静脉注射后能迅速通过血液循环向组织液分布，能较快的到达靶器官，有利于减少早期显像时心脏与大血管的影像干扰。消除相半衰期表示血液药物浓度下降一半所需要的时间，反应药物在血中维持时间的长短及从体内消除的快慢。t1／2β（123.125 min）符合小分子多肽血液清除快的特点，能保证常规显像时间内软组织处于低放射性本底，并有利于减少对其他组织器官的辐射损伤。这也与 c（RGD）2多肽结构的预期设计一致，我们在c（RGD）2结构中引入了两个D型丝氨酸以增加它的水溶性，以加快多肽在正常组织中的清除、降低肝脏摄取，提高肿瘤与正常组织的靶本比。K12值大于K2l值，提示131I-c（RGD）2在裸鼠体内的分布达到暂时平衡后，进入组织液中的量大于离开量，保证了高表达 αvβ3受体的肿瘤新生血管内皮细胞与放射性核素标记的c（RGD）2有充足的时间进行结合。表观分布容积（Vd）是给药剂量与血药浓度的一个比值，表观分布容积大，说明药物分布广，组织摄取多，而血药浓度低。该多肽Vd值为 0.880，因此该多肽组织摄取多而血液中浓度低，组织与血液本底的比值高，可以得到高质量的图像。

对以上参数进行分析可知，静脉注射131I-c（RGD）2后可在短时间内行αvβ3受体阳性肿瘤显像，且延迟显像可获得低血池本底及高质量的图像，这与我们前期的显像研究结果一致，在前期我们选用了αvβ3受体高表达的神经胶质瘤裸鼠模型，静脉注射131I-c（RGD）2后3 h即可获得高对比度的肿瘤显像图像，静脉注射后 5 h、24 h时行延迟显像图像质量更佳［7］。本实验为在注射131I-c（RGD）2后的较短时间内行核素显像，并获得低血池本底及高质量图像提供了理论依据。

通过V-life软件分子对接程序设计合成的二硫键成环的c（RGD）2多肽结构简单、合成容易，标记方便、标记率高，该药物具有良好的药代动力学特点，且急性毒性试验未见不良反应，这些均有利于其作为新药应用于临床肿瘤的显像研究。

［1］Seong J，Wang N，Wang Y.Mechanotransduction at focal adhesions：from physiology to cancer development.J Cell Mol Med，2013，17（5）：597-604.

［2］Robinson S D，Hodivala-Dilke K M.The role of beta3-integrins in tumor angiogenesis：context is everything.Curr Opin Cell Biol，2011，23（5）：630-637.

［3］Haubner R，Wester H J，Reuning U，et al.Radiolabeled αvβ3integrin antagonists：a new class of tracers for tumor targeting.J Nucl Med，1999，40（6）：1061-1071.

［4］Gaertner F C，Kessler H，Wester H J，et al.Radiolabelled RGD peptides for imaging and therapy.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2012，39 Suppl 1：S126-138.

［5］张丽，张春丽，王荣福，等.RGD多肽类药物设计、活性测定及99mTc-cRGD二聚体的制备.核化学与放射化学，2011，33（2）：106-113.

［6］张春丽，郝攀，成彧，等.131I-c（RGD）2在荷不同类型肿瘤小鼠中的生物分布与显像研究.肿瘤学杂志，2014，20（11）：875-880.

［7］von Wallbrunn A，Holtke C，Zuhlsdorf M，et al.In vivo imaging of integrin αvβ3expression using fluorescence-mediated tomography.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2007，34（5）：745-754.

（潘子昂编辑）

Pharmacokinetics and Acute Toxicity Study of131I-c（RGD）2

MA Huan，HAO Pan，MA Chao，YAN Ping，LIU Min，WANG Rong-fu，CHEN Xue-qi，ZHANG Chun-li
（Department of Nuclear Medicine，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China）

Objective To evaluate the safety，pharmacokinetics and acute toxicity of131I-c（RGD）2in nude mice.Methods Five nude mice were injected with131I-c（RGD）2via tail vein（7.4 MBq in 200 μL／mouse）and blood samples（5 μL）were collected by cutting down the tail end at 3，6，10，15，30，45，60，120，180 and 360 min after administration.The radioactive accounts of blood samples were measured using a γ-counter and the pharmacokinetics data was calculated by the PKSolver software.10 nude mice were randomly divided into 2 groups，the experimental group and the control group，for the acute toxicity study.The experimental mice were injected with131I-c（RGD）2via tail vein（7.4 MBq in 60 μL／mouse）and the control mice were injected with saline（60 μL／mouse）to observe the adverse reaction.Results The blood dynamics of131I-c（RGD）2in nude mice conformed to the two-compartment model with the weight of 1／CC，and t1／2αand t1／2βwere 15.364 min and 123.125 min respectively.No adverse reaction was observed within 72 h after injection.Conclusion The ideal pharmacokinetic characteristics and tissue tolerance of131I-c（RGD）2suggest it to be a potential agent in clinical practice.

Pharmacokinetics； RGD peptide； Acute toxicity

10.11748／bjmy.issn.1006－1703.2016.01.024

2015-11-03；

2015-11-26

北京市自然科学基金（7112129）

张春丽，研究员，博士。E-mail：zhangcl0326＠sina.com