锰素对甘蔗脯氨酸合成积累的影响

杨 善，谢 平，李广翔，叶昌辉，周鸿凯

(广东海洋大学 农学院，广东 湛江 524088)



锰素对甘蔗脯氨酸合成积累的影响

杨 善，谢 平，李广翔，叶昌辉，周鸿凯*

(广东海洋大学 农学院，广东 湛江 524088)

以粤糖55为材料，设6个锰处理水平，分别在正常水分和干旱条件下，通过桶栽试验，测定叶片的叶绿素、脯氨酸含量与Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和δ-鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性及其基因表达。结果表明，随着施锰量的增加，2种水分条件下，所有测定指标均呈先增加后减小的趋势。干旱胁迫下，脯氨酸含量在锰浓度为0.8 g·kg-1时达到最大；δ-OAT，P5CS活性与叶绿素含量在锰浓度为0.4 g·kg-1时达到峰值；δ-OAT，P5CS基因表达量则是在0.2 g·kg-1供锰条件下最大。正常水分下，叶绿素含量、脯氨酸含量、δ-OAT活性变化与干旱胁迫时相似；P5CS活性在0.8 g·kg-1时达到最大，但增幅不大。统计分析结果表明，正常水分和干旱胁迫条件下，与脯氨酸含量的简单、偏相关系数和直接通径系数均达到极显著水平的分别是P5CS活性和δ-OAT活性。由此认为，在砖红壤土中，为保证甘蔗具有较强抗逆性，甘蔗的施锰量应为0.2～0.4 g·kg-1。在锰的影响下，干旱胁迫时，甘蔗脯氨酸的合成途径以鸟氨酸途径为主；正常水分时，脯氨酸的合成则是谷氨酸途径更占优势。

甘蔗；锰；脯氨酸；P5CS；δ-OAT；基因表达

当植物受到重金属、干旱、高盐等逆境胁迫时，为了适应逆境，植物体会在短时间内积累大量的脯氨酸、甜菜碱等一系列渗透调节物质[9]。杨建波等[10]研究表明，在干旱胁迫处理下，不同品种甘蔗的生长势、叶片水势及叶绿素含量均有不同程度降低，叶片脯氨酸和丙二醛含量升高，叶片细胞质膜透性增大。在植物体内，脯氨酸的生物合成途径一般分为谷氨酸途径(Glu→Pro)和鸟氨酸途径(Orn→Pro)，△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和δ-鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)分别是前述2个合成途径的关键酶[11-12]。余光辉等[13]研究表明，假俭草在干旱胁迫下主要通过Orn→Pro途径积累脯氨酸。王华[14]研究表明，在盐胁迫下，鸟氨酸途径主导着海滨锦葵根中脯氨酸的合成，而叶片中脯氨酸的合成以谷氨酸途径为主。

前人对干旱胁迫下甘蔗脯氨酸的合成积累效应研究很多[15-16]，但针对不同水分条件下，不同锰浓度对甘蔗脯氨酸合成积累效应的研究尚未见报道。本研究以粤糖55为材料，设6个锰浓度水平，分别测定了在正常水分和干旱胁迫下，植株体内游离脯氨酸含量与P5CS，δ-OAT活性及其基因表达，以探索不同外源锰浓度水平对甘蔗叶片游离脯氨酸合成积累效应的影响，以期为甘蔗栽培技术创新提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用甘蔗品种为粤糖55，是粤西蔗区主栽品种之一。供试土壤为砖红壤土，部分理化性质如下：pH值5.08，碱解氮152.12 mg·kg-1，速效钾158.56 mg·kg-1，有效磷53.27 mg·kg-1，有机质27.80 g·kg-1，活性锰128 mg·kg-1。

1.2 试验方法

采用桶栽试验(胶桶高0.5 m，口径0.4 m，在桶底开4个对称的排水小孔)，每桶装砖红壤土20 kg，种植2段双芽苗。试验设置6个锰素处理水平，分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 g·kg-1。随机区组设计，3次重复，共计18桶。试验处理设2个生长条件：土壤含水量>20%，作为正常条件；土壤含水量<14%，作为干旱胁迫。

于2013年6月18日种植，田间管理按大田管理水平操作。齐苗后定苗，每桶选留对称且健壮的2株甘蔗幼苗，用自来水浇灌，保持土壤湿润。2013年10月2日，以MnSO4·5H2O作为锰素施入土壤中，按锰含量(以Mn2+计)要求，每桶均匀施入相应含量的MnSO4溶液1 L。于2013年10月30日、11月18日、11月27日分别取甘蔗+1叶测定叶片中活性锰含量。于2013年11月20日，实测土壤水分为(20.58±2.42)%， 每桶取1株甘蔗进行测试分析，取其+1叶测定脯氨酸含量、δ-OAT活性、P5CS活性，取其心叶作为总RNA提取材料。随后，将试验桶栽甘蔗移入通风透气良好的玻璃室内，停水管理，进行6 d干旱胁迫处理，于2013年11月27日，实测土壤含水量为(12.65±1.34)%，取样，同上分析测试各项目。

1.3 测定项目及方法

叶绿素含量测定采用乙醇-丙酮混合液浸泡法；脯氨酸含量测定用茚三酮显色法[17]；P5CS提取参照Hayzer等[18]的方法，活性测定参照韩晓玲[19]的方法，一个酶活性单位(1 U)定义为每分钟生成1 μmol γ-谷氨酰胺所需要的酶量；δ-OAT的抽提、活性测定参照余光辉等[13]的方法，一个酶活性单位(1 U)定义为每小时生成1 mmol P5C所需要的酶量；叶片中锰含量采用原子吸收分光光度法测定[20]。

总RNA用TRNzol-A+总RNA提取试剂盒提取，利用TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒反转录，上述试剂盒均购自天根生化科技公司；用宝生物工程公司的SYBR®Premix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂盒，在Roche LightCycler®2.0平台上进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，基因表达分析采用2-△△Ct法[21]，以正常水分时的基因表达为1。

利用软件Primer Premier 5.0按照GenBank中甘蔗P5CS基因(EU005373.2)、δ-OAT基因的cDNA序列(EF517495.1)设计引物，具体如下：P5CS的引物分别为5′-GTGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，5′-AGGAAGGTTCTTATGGGT-3′；δ-OAT的引物分别为5′-GAGTTTAGGGACCAGTTACAGAA-3′， 5′-AAGCAGGAGATAGAGCGTCAT-3′。其中，内参基因引物则引用阙友雄等[22]筛选的25SrRNA引物组合： 5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′，5′-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3′。

1.4 统计分析

本研究所有数据的统计分析在SPSS 19.0上进行；对于有显著差异的各指标，用LSD法对不同处理水平进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 甘蔗叶片锰含量

由图1可知，随着施加锰浓度的增加，叶片锰含量也随之增加。在相同测定时间下，除正常水分时的0与0.2 g·kg-1间的叶片锰含量没有显著性差异外，其他锰浓度处理的叶片锰含量均有显著差异。同时，对比正常水分(11月18日)和干旱胁迫(11月27日)条件下各施锰处理的叶片锰含量，其值基本趋于稳定，说明甘蔗对于外源锰的吸收已经达到一个平衡状态。

2.2 甘蔗叶片叶绿素含量

由图2可知，2种水分条件下，甘蔗叶片叶绿素含量都随着施锰素的增加而呈现先增后减的趋势，无论是在正常水分还是干旱胁迫下，均在施锰浓度为0.4 g·kg-1时达到最大，且显著高于其他供锰水平；在施锰浓度为1.6 g·kg-1时最小，且显著低于其他供锰水平。说明适量的锰素有利于甘蔗叶片叶绿素的合成，而过量的锰素则会阻碍叶绿素的正常合成。对比2种水分条件，干旱胁迫下叶绿素含量总体较正常水分下降了24.81%，表明干旱胁迫会使甘蔗叶片叶绿素含量下降。

图中各处理间无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)图1 不同锰浓度对甘蔗叶片锰含量的影响Fig.1 Effects of different Mn application rates on Mn content in sugarcane leaves

在正常或干旱胁迫条件下，不同锰浓度间无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同图2 不同锰浓度对甘蔗叶片叶绿素含量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of manganese on chlorophyll content in sugarcane leaves

2.3 甘蔗叶片游离脯氨酸含量

图3显示，在2种水分条件下，甘蔗体内游离脯氨酸含量均随着锰施用量的增加而呈现先增后减的趋势。干旱胁迫下，当锰施用浓度小于0.8 g·kg-1时，植株内游离脯氨酸的含量随着施锰浓度的增加而显著增加；大于0.8 g·kg-1时下降。即适当量的锰素会促进甘蔗植株内游离脯氨酸的合成积累；但是，当锰施用浓度大于0.8 g·kg-1时，表现出抑制作用。正常水分下，自施锰浓度为0.4 g·kg-1起，脯氨酸含量开始显著增加，至0.8 g·kg-1时达到峰值，之后随锰施用浓度的增加而显著下降，说明在正常水分条件下，当施锰浓度增加到0.4 g·kg-1时，甘蔗植株开始受到锰胁迫的影响。

2.4 甘蔗叶片δ-OAT活性

由图4可知，在干旱条件下，随锰施用量的增加，δ-OAT活性变化表现为抛物线状，在锰浓度为0.4 g·kg-1时达到峰值，比对照(0 g·kg-1)增加了44.62%。超过0.8 g·kg-1时，δ-OAT活性显著下降。正常水分条件下，δ-OAT活性亦表现为先增后减的趋势，但波动较干旱条件下小。

图3 不同锰水平对甘蔗叶片脯氨酸含量的影响Fig.3 Effects of different concentrations of manganese on proline content in sugarcane leaves

图4 不同锰水平对甘蔗叶片δ-OAT活性的影响Fig.4 Effects of different concentrations of manganese on δ-OAT activity in sugarcane leaves

总体来看，适量的锰可激活δ-OAT活性，合成更多的脯氨酸来调节甘蔗植株的生长；而过多的锰则会抑制δ-OAT活性。

2.5 甘蔗叶片P5CS活性

由图5可知，在2种水分条件下，P5CS活性的变化趋势与δ-OAT相似。正常水分下，P5CS活性在0.8 g·kg-1时达到最大值，之后缓慢减小。而干旱胁迫下，随着施锰量增加，P5CS活性被激活，在0.4 g·kg-1时最大，随后减小。即适量的锰能够激活P5CS活性，而锰施用量过大则有一定的抑制作用。干旱胁迫与正常水分状况比较，干旱胁迫时P5CS的平均活性比水分正常条件下增加了68.74%。因此，推测土壤水分是激活P5CS活性的主要因素，而锰的施用量对P5CS活性也有一定的影响。

2.6 δ-OAT，P5CS基因表达

由图6可知，除施锰浓度为1.6 g·kg-1外，干旱胁迫下δ-OAT，P5CS相对于正常水分条件下的基因表达量呈增大的趋势。由此说明，干旱胁迫下能诱导δ-OAT，P5CS基因表达量的上调，这与δ-OAT，P5CS活性的变化趋势是相似的。在不同外源锰浓度下，δ-OAT，P5CS的基因表达量表现出显著差异，当施锰浓度为0.2 g·kg-1时，δ-OAT，P5CS基因表达量最大，分别为正常水分条件下的3.0，2.95倍；当锰浓度大于0.4 g·kg-1时，δ-OAT，P5CS基因表达量的上调幅度均小于对照(0 g·kg-1)，特别是当锰浓度为1.6 g·kg-1时，相较于正常水分条件，δ-OAT基因表达下调。总体来看，适当的锰有利于诱导δ-OAT，P5CS基因在干旱胁迫条件下的表达，而施锰浓度过大则会抑制δ-OAT，P5CS基因在干旱条件下的表达上调幅度。

图5 不同锰水平对甘蔗叶片P5CS活性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of manganese on P5CS activity in sugarcane leaves

图6 不同锰水平对甘蔗δ-OAT，P5CS基因表达的影响Fig.6 Effects of different concentrations of manganese onδ-OAT and P5CS gene expression in sugarcane leaves

2.7 相关性及通径分析

从表1可知，正常水分条件下，只有P5CS活性与脯氨酸含量间的简单相关系数、偏相关系数均达到极显著性水平，且为正相关；δ-OAT活性与叶绿素含量的简单相关系数达到显著性水平，偏相关系数达到极显著性水平，均为正相关；P5CS活性与叶绿素含量之间的偏相关系数达到显著性水平，为负相关。因此，正常水分时，在锰素的影响下，δ-OAT活性与叶绿素含量、P5CS与脯氨酸含量间的关系极为密切，而P5CS活性与叶绿素含量间也有紧密联系。干旱胁迫下，在各个生理指标间的简单相关系数中，唯有叶绿素与脯氨酸含量间的系数未到达显著性水平；而在偏相关分析中，只有δ-OAT活性与脯氨酸含量间的偏相关系数达到了显著性水平，且为正相关。由此表明，干旱胁迫下，δ-OAT与脯氨酸含量间的关系最为密切。

由表2可知，正常水分下，只有P5CS活性对脯氨酸含量的通径系数达到极显著水平，为0.737 8。而δ-OAT活性、叶绿素含量对脯氨酸含量的直接通径系数分别为0.100 8，0.188 3，所以，P5CS活性对脯氨酸含量的调节作用最大。干旱胁迫下，只有δ-OAT活性对脯氨酸含量的直接通径系数达到了极显著水平；而P5CS活性对脯氨酸含量的直接通径系数较小，为0.376 4；叶绿素含量对脯氨酸含量的直接通径系数为-0.204 8，为负向的调节作用；同时，P5CS活性、叶绿素含量通过δ-OAT活性的间接通径系数都比较大，说明此时对脯氨酸的合成积累以δ-OAT活性调节为主。

表1 各生理指标间的简单、偏相关性分析

Table 1 The simple and partial correlation analysis of physiological indexes

参数δ-OAT活性X1正常水分干旱胁迫P5CS活性X2正常水分干旱胁迫叶绿素含量X3正常水分干旱胁迫脯氨酸含量Y正常水分干旱胁迫δ-OAT活性X1110.30240.13360.7012**0.43300.10170.5948*P5CS活性X20.22120.7142**11-0.5029*0.39490.6857**0.4001叶绿素含量X30.6397*0.6566**-0.25180.6448**110.1861-0.2480脯氨酸含量Y0.38450.7810**0.7127**0.7062**0.06700.462511

注：左下表示简单相关系数，右上表示偏相关系数。*表示达显著水平(P<0.05)，**表示达极显著水平(P<0.01)。下同。

表2 通径分析结果

Table 2 Results of path analysis

参数直接通径系数正常水分干旱胁迫通过X1通径系数正常水分干旱胁迫通过X2通径系数正常水分干旱胁迫通过X3通径系数正常水分干旱胁迫剩余通径系数正常水分干旱胁迫X10.10080.6467**0.16320.21640.1204-0.13450.42280.3238X20.7378**0.37640.02230.4618-0.0474-0.1321X30.1883-0.20480.06450.4246-0.18580.2427

注：X1为δ-OAT活性；X2为P5CS活性；X3为叶绿素含量。

3 讨论

3.1 锰素对甘蔗叶片叶绿素含量的影响

锰直接参与光合作用，维持叶绿体的结构；同时，锰与蛋白质结合形成的酶蛋白是光合作用中不可缺少的参与者[23]。本研究中，叶绿素含量在2种水分条件下均呈现先增后减的趋势，并且均是在锰浓度为0.4 g·kg-1时达到最高；随着锰素的增加，叶绿素含量开始减少，表明适量的锰素(即小于0.4 g·kg-1)有利于甘蔗叶片叶绿素的合成，而过量的锰素(大于0.4 g·kg-1)会阻碍叶绿素的正常合成。这一结果和孙玉珍等[4]以3种花卉为材料，进行锰胁迫的盆栽试验结果相似。铁是合成植物叶绿素的必须元素之一。锰素过量时，叶绿素含量减少，使得甘蔗叶片失绿、黄化，这可能与锰胁迫下甘蔗对铁的吸收、运输、钝化有关[24]。

3.2 锰素对甘蔗叶片游离脯氨酸的积累效应

本研究发现，在干旱胁迫下，施用适量的锰时，能够提高δ-OAT，P5CS基因的表达量，在锰浓度为0.2 g·kg-1时上述基因表达较正常水分条件下的上调幅度最大。同时，甘蔗叶片的δ-OAT，P5CS活性不断增大，游离脯氨酸含量也显著积累，以提高抗逆能力，维持体内正常的渗透压，抵抗干旱胁迫对植株带来的伤害。这与彭令发等[25]以玉米为材料的研究结果类似，即适量的锰素能够提高玉米对干旱胁迫的抗逆性。当锰施量大于0.8 g·kg-1时，δ-OAT，P5CS活性受到抑制作用，游离脯氨酸的含量也随之下降。这可能是由于过多锰的吸收抑制了植物对铁、镁、钙的吸收[8]，使得甘蔗体内的元素平衡遭到破坏，从而抑制了各种代谢活动，使得脯氨酸合成受阻。

在正常水分条件下，随着锰施用量的增加，游离脯氨酸含量变化与干旱胁迫时的趋势类似，当锰施量在0～0.2 g·kg-1时，甘蔗尚未受到锰的胁迫，而大于0.4 g·kg-1时，脯氨酸含量剧增，大量游离脯氨酸积累，表明植物可能已经受到锰胁迫。δ-OAT活性在锰施用量为0.4 g·kg-1时才被显著激活；而P5CS活性则在锰施用量为0.2 g·kg-1时即被显著地激活。这可能是由于镁素能活化谷氨酰胺合成酶，参与谷氨酸、谷氨酰胺的合成[26]，因此，P5CS活性对锰胁迫更为敏感。

综上，甘蔗在干旱胁迫下，锰的施用量应以0.4 g·kg-1最佳，此时甘蔗抗旱性最强，叶绿素含量最高，P5CS，δ-OAT基因表达量比较大，脯氨酸含量也比较高；而在正常水分下，锰肥的施用量应控制在0.2 g·kg-1，此时甘蔗未受到锰胁迫，利于甘蔗植株的正常生长。因此，在砖红壤土中，锰的施用量宜控制在0.2～0.4 g·kg-1。

3.3 锰素对甘蔗叶片游离脯氨酸合成途径的影响

在干旱、重金属、高盐等胁迫下，脯氨酸的合成调节究竟是谷氨酸途径还是鸟氨酸途径占主导地位，至今尚未有统一的结论，但都认为与植物种类、生长状态有关[27]。赵福庚等[28]认为，盐胁迫下明显激活大麦幼苗体内脯氨酸合成的鸟氨酸途径；而Roosens等[29]以4周龄的拟南芥为材料研究表明，盐胁迫下主要是谷氨酸途径引起植株体内游离脯氨酸的增加。本研究发现，在干旱胁迫下，随着锰施入量的增加，δ-OAT活性被显著激活，呈先增大后减小的趋势，与脯氨酸含量的变化有一致性，而P5CS活性增幅较小。同时，通过分析发现，只有δ-OAT活性与脯氨酸含量的简单、偏相关系数均达到了极显著性水平；而P5CS活性并未达到显著水平。由此推测，在锰素的影响下，干旱胁迫条件下，甘蔗体内游离脯氨酸的合成以鸟氨酸途径为主，这与黄诚梅等[30]以PEG胁迫模拟干旱胁迫，认为甘蔗叶片中脯氨酸的合成以谷氨酸途径主导的结论不同。本研究还发现，在正常水分下，脯氨酸合成积累量比干旱胁迫时小。随着锰施入量的增加，δ-OAT，P5CS活性先增大后减小，而δ-OAT活性的增幅很小。进一步的分析表明，唯P5CS活性与脯氨酸含量的简单、偏相关系数均达到了极显著性水平，且通径分析中P5CS活性对脯氨酸含量的直接通径系数明显大于δ-OAT。由此推测，在锰影响下，正常水分条件下甘蔗体内游离脯氨酸的合成途径中Glu→Pro比Orn→Pro更占优势，所以P5CS对锰素较为敏感。但此条件下的剩余通径较大，说明脯氨酸的合成还有其他随机因子的影响，需进一步探索。

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(责任编辑 高 峻)

Effects of manganese on proline biosynthesis and accumulation in sugarcane

YANG Shan， XIE Ping， LI Guang-xiang， YE Chang-hui， ZHOU Hong-kai*

(CollegeofAgriculture，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，China)

In the present study， the sugarcane variety YT-55 was selected as study material. Under drought and normal conditions， the activity of P5CS， δ-OAT and their gene expression， and contents of free proline and chlorophyll were tested under 6 Mn concentrations， respectively. It was shown that all indexes tested exhibited a first increasing and then decreasing trend with the elevated Mn application rates under two water conditions. Under drought stress， the proline content reached the maximum when manganese concentration was 0.8 g·kg-1， the activity of δ-OAT and P5CS activity and chlorophyll content reached the peak under 0.4 g·kg-1Mn， and the gene expression level ofδ-OATandP5CSreached the maximum when manganese concentration was 0.2 g·kg-1. Under normal conditions， changes of chlorophyll and proline contents and δ-OAT activity were similar to those under drought stress. The activity of P5CS reached maximum when manganese concentration was 0.8 g·kg-1. The simple， partial correlation and direct path coefficients of δ-OAT activity and proline content reached significant level under drought stress， while the simple， partial correlation and direct path coefficients of P5CS activity and proline content reached significant level under normal condition. This study suggested that manganese application amount should be 0.2-0.4 g·kg-1for sugarcane production in latosol soil， and the stress resistance of sugarcane was strong under this condition. Due to the influences of manganese， the ornithine pathway dominated the proline biosynthesis of sugarcane under drought stress， while the glutamic pathway was dominant under normal water condition.

sugarcane; manganese; proline;P5CS;δ-OAT; gene expression

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.03

2015-10-21

广东省科技计划项目(2013B020301005，2013B020301008)；广东省良种培育和引进专项(201201148)；广东海洋大学“强校工程”科研项目(GDOU2015050201)

杨善(1987—)，男，广西贺州人，硕士研究生，从事热带作物栽培生理研究。E-mail：116168836@qq.com

*通信作者，周鸿凯，E-mail：897961801@qq.com

S566.1

A

1004-1524(2016)06-0915-07

杨善，谢平，李广翔，等. 锰素对甘蔗脯氨酸合成积累的影响[J]. 浙江农业学报，2016，28(6)： 915-921.