多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒混合感染的诊断

马莉莉，王宇婷，赵微，翟军军，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒混合感染的诊断

马莉莉，王宇婷，赵微，翟军军，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

大庆市某猪场发生以高热稽留、呼吸困难以及食欲废绝等为临床症状，部分仔猪甚至死亡的疫情。无菌采集病料，提取病变组织DNA或RNA进行猪瘟病毒、圆环病毒的PCR或RT-PCR检测，同时进行细菌分离培养等试验。PCR扩增出700 bp的猪圆环病毒特异性条带。诊断为多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒混合感染。

圆环病毒；巴氏杆菌；混合感染；诊断

猪圆环病毒病（Porci neci rcovi rus di sease）是由猪圆环病毒2型（Porci neci rcovi rus 2，PCV2）导致的患病猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统器官功能衰竭的一类疾病的统称[1]。临床上的主要表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征（PM W S）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、新生仔猪先天震颤（CT）[2]。不同年龄的猪都可感染猪圆环病毒，病猪可通过鼻液、粪便等排泄物排出病毒，经口腔和呼吸道途径可传染给健康的猪[3]。猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种传染性疾病，又名猪肺疫，急性病例呈现出血性败血症，咽喉部急性肿胀，高度呼吸困难[4]。长途运输或频繁迁移、过度疲劳、饲料突变、营养缺乏等也常常诱发此病。2016年4月，黑龙江大庆某猪场发生以生长缓慢、体温升高、呼吸困难等为主要特征的传染病，该猪场养仔猪80头，发病率20%，死亡率6%，于发病后2 d送诊，实验室剖检后无菌采集病死猪肝脏、肺脏、肾脏和淋巴结等病料，进行病原学检测。

1 材料与方法

1.1病料的采集无菌采集病死猪的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结等病料，供实验室诊断用。

1.2试剂M arker DL 2000购自大连宝生物工程有限公司；PCR M aster M i x缓冲液、TIAN am p Genomi c DN A Ki t和RN easy Pl us M i niH andbook RN A购自北京博凌科为生物科技有限公司；RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t购自赛默飞世尔科技中国有限公司。药敏纸片包括多粘菌素B、庆大霉素、硫酸头孢喹肟和盐酸头孢噻呋混悬液等购于浙江海正药业股份有限公司。

1.3引物设计根据GenBank中已发表的猪瘟病毒、圆环病毒、多杀性巴氏杆菌和链球菌的基因序列设计特异引物，并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。详见表1。

1.4细菌分离培养无菌操作采集肝脏和肺脏等病料，接种5%兔血脂培养基和营养琼脂培养基，置37℃恒温箱中培养24 h，观察菌落形态和溶血等情况。挑取疑似菌的单个菌落进行纯培养，划线于鲜血琼脂培养基，37℃恒温箱中需氧培养24 h，观察菌落形态等。

1.5核酸的提取及鉴定

1.5.1组织DNA和RNA提取按照TIAN am p Genom i c DN A Ki t操作进行提取DN A；按照RN easy Pl us M i niH andbook RN A提取盒进行提取RN A，-20℃保存备用。

表1 引物序列Table1Primer sequences

1.5.2RNA反转录和PCR扩增按RevertAi d Fi rst Strand cDN A Synthesi s Ki t反转录盒说明书操作步骤将病毒提取的RN A进行反转录，得到的cDN A在-20℃进行保存备用。用得到的DN A和cDN A为模板，猪瘟病毒、高致病性蓝耳病毒、圆环病毒、多杀性巴氏杆菌、链球菌等特异性引物进行PCR反应扩增，取5 μL的扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6药敏试验将鉴定为多杀性巴氏杆菌的纯培养物用接种棒均匀涂布在鲜血培养基上，将药敏纸片（庆大霉素、卡那霉素、恩诺沙星等10种药物）分别贴于平皿中，37℃培养24 h，测定抑制菌圈直径大小，根据检测标准判定结果。

2 结果与分析

2.1剖检变化病理变化表现为全身黏膜、浆膜出血，肠管充血，淋巴结水肿；气管内有泡沫状样黏液；肺脏有不同程度的肝变区，间质增宽，整个肺呈纤维素性变化，切面呈大理石样纹理，淤血呈紫红色；心肌变性，质地松软，心包液增多，见图1和图2。

2.2革兰氏染色将病料中所分离的细菌进行纯培养，然后对其进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见到革兰氏染色阴性杆菌，染色可见两极浓染的球杆菌，疑似多杀性巴氏杆菌，见图3。

图1 气管内有泡沫状黏液Fig.1The trachea with foamy mucus

图2 肺脏淤血水肿Fig.2Congestion edema of the lungs

图3 两极浓染球杆菌（10×10）Fig.3Two levels of dyeing ball coli（10×10）

2.3PPCCRR结果PCR或RT-PCR检测结果表明，第4孔在700 bp左右有一条清晰的条带，与圆环病毒预期片段大小相符；第6孔在450 bp左右有一条清晰的条带，与巴氏杆菌预期片段大小相符，见图4。

2.4药敏试验结果该病原菌对硫酸头孢喹肟和盐酸头孢噻呋高度敏感,对卡那霉素、恩诺沙星、阿米卡星和多粘菌素B敏感，对青霉素、庆大霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐药，详见表2。

图4 PCR电泳分析图Fig.4PCR electrophoresis analysis chart

表2 药敏结果Table2The results of drug susceptibility

3 讨论

3.1猪圆环病毒经常呈现隐性感染，要定期进行检测，并且淘汰病猪，避免混合感染导致其他的疾病[5]。治疗多杀性巴氏杆菌要根据要药敏结果进行致病菌特性，合理使用抗生素且不可随意用药。

3.2饲养管理应加强，周围环境卫生要处理好，增强家畜的抵抗力非常关键[6]。发现病猪最好隔离，创造舒适环境，有利于疾病的康复。建立规模化养猪场防疫管理等制度，实行全进全出，定期对猪群进行监测，圈舍和用进行消毒，病死猪进行深埋处理，猪舍净化[7]。保育猪转舍，育肥猪出栏后，要最少空舍2周，2周内至少要消毒2次以及体外净化等[8]。

3.3用商品化疫苗对母猪进行免疫[9]，做好各种疾病的预防接种，免疫母猪使得仔猪能从初乳中获得母源的抗体保护，能够在5周内有效避免PCV2的感染[10]。更应该注意饲养的密度，减少不良因素的应激，可减少疾病的发生。

3.4本次该猪场发病在临床诊断的基础上，采用病原的分离鉴定和PCR鉴定，诊断为多杀性巴氏杆菌和猪圆环病毒混合感染，根据药敏试验结果推荐使用硫酸头孢喹肟进行治疗。

[1]郎洪武，王力，张广川，等.猪圆环病毒病及生物制品学的研究进展[J].中国兽医科学，2012，42（5）：545-550.

[2]宋长绪，梁鹏帅.猪圆环病毒研究进展[J].广东农业科学，2010（9）：34-37.

[3]Stevenson GM,Ki upel M,M i ttal SK.Ti ssue di stri buti onandgeneti ctypi ngofporci ne ci rcovi rusi n pi gsw i th natural l yoccurri ng congeni taltrem ors[J].VetDi agnInvest, 2001,13(1):57-62.

[4]甘孟候，杨汉春.中国猪病学[M].北京：中国农业出版社，2005：177-182.

[5]朱凤琼，孟志宏，陈少美.猪多杀性巴氏杆菌病的诊治[J].云南畜牧兽医，2004（2）：43.

[6]杨家飞.猪瘟和猪肺疫的混合感染诊治[J].贵州畜牧兽医，2013（3）：42-43.

[7]梁晓芹，宋永阁.猪肺疫的临床及综合防制[J].农村实用科技信息，2009（4）：38.

[8]丁明彬，王光芳，王红霞，等.猪肺疫的防制[J].中国畜牧兽医，2009，36（2）：118-119.

[9]Burch D.Ci rovi rus now for the good new s[J]. Pi gs i nternati onal,2007(5):15-17.

[10]张文奎.猪肺疫的诊断与防制[J].山东畜牧兽医，2013（3）：21-22.

Diagnosis of the combined infection with Circovirus and Pasteurella of swine

M a Li l i,W ang Yuti ng,Zhao W ei,Zhai J unj un,N i H ongbo*
(Col l ege of ani m al sci ence and technol ogy,H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng 163319)

A pi g farmw i th fever,di ffi cul ty breathi ng and l oss of appeti te as the cl i ni cal sym ptom s i n the ci ty ofDaqi ng,som e pi gs even death.Col l ected asepti cal l y di seased ti ssue extract DN A or RN A for PCR or RT-PCR detecti ng ci rcovi rus and sw i ne fever vi rus,w hi l e for bacteri al i sol ati on tests.PCR am pl i fi ed 700 bp porci ne ci rcovi rus speci fi c bands.By l aboratory di agnosi s a pi g farmpi gs di ed,the eti ol ogy of the di sease i s di agnosed w i th Pasteurel l a and Ci rcovi rus combi ned i nfecti on.

Ci rcovi rus;Pasteurel l a;Com bi ned i nfecti on;Di agnosi s

S858.28

B

1672-9692(2016)07-0036-04

2016-05-18

马莉莉（1992-），女，黑龙江人，在读硕士，研究方向为分子细菌学和免疫学。

倪宏波（1972-），男，黑龙江人，教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究。

博士科研启动基金（编号：LBH-Q 14134）。