牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

毕莹，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

毕莹，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

为了对牛病毒性腹泻病毒进行分离鉴定，本试验通过对黑龙江省完达山牛场疑似感染牛病毒性腹泻病毒患牛的直肠粪便以及鼻拭子进行无菌采集，样品经常规处理后接种于MDBK细胞，盲传3次以及PCR扩增鉴定，最后对收集到的病毒进行蚀斑纯化试验。结果表明，病毒MDBK细胞出现明显病变，PCR鉴定与预期结果相符，3次蚀斑纯化后分离到该病毒。结论可成功分离到牛病毒性腹泻病毒。

牛病毒性腹泻病毒；MDBK；鉴定；蚀斑纯化

牛病毒性腹泻病（Bovi ne vi raldi arrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovi ne vi raldi arrhea vi rus，BVDV）引起的传染病，各种年龄的牛都易感染，以犊牛易感性最高。BVDV是黄病毒科瘟病毒属成员[1]，单股RN A、有囊膜的病毒。基因组全长12.5 kb，其开放阅读框共编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白[2-3]。BVDV根据基因组5'-UTR序列，分为BVDV-1和BVDV-2型，其中BVDV-1有很多亚型，目前已分出18种亚型1a-1t，BVDV-2分为4个亚型2a～2d[4]。其中BVDV-1型呈全球性广泛分布，BVDV-2型仅有部分国家流行[5]。国外最早是在1946年发现BVDV，而我国在1980年成功分离并鉴定BVDV，并在我国20多个省市都报道了该病[6]。根据是否发生细胞病变，可分为两种生物型，即致细胞病变型（cytopathogeni c，CP）和非致细胞病变型（noncytopathogeni c，N CP）。BVDV的流行给国内外养牛业的发展带来很大损失，BVDV可引起呼吸综合征、先天性缺陷、免疫抑制、繁殖障碍、肠炎、母畜流产等症状[7]。本试验通过采集临床疑似牛病料，处理后接种于M DBK细胞进行盲传，提取病毒RN A，通过PCR扩增鉴定为BVDV1b型，并采用蚀斑纯化分离病毒。

1 材料与方法

1.1引物设计采用O l i go7软件在5’UTR保守区设计1对引物，由哈尔滨博仕生物有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5’-ATGCCCTATAGTAGGACTAGCA-3’；下游引物：5’-TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3’。

1.2方法

1.2.1细胞培养与病毒的分离鉴定将M DBK细胞用PBS缓冲液冲洗3次，0.25%浓度胰酶消化，置于37℃CO2培养箱中消化3～5 m i n，弃掉胰酶，加入培养液（5%血清，1%双抗DM EM），反复吹吸细胞，使细胞分散，镜下观察，置于37℃CO2培养箱培养。

将采集的3头牛的粪便以及鼻拭子进行处理，粪便用PBS缓冲液3倍稀释，12 000 r/m i n离心，鼻拭子经适量PBS稀释，参照病毒RN A提取试剂盒（Q IAGEN）说明书提取RN A，按照M-M u LV反转录试剂盒进行反转录制备cDN A，以cDN A为模板进行PCR扩增，体系如下：PCR M aster M i x：12.5 μL；上游引物、下游引物（BVDV鉴定引物）各1 μL；cDN A：3 μL；加去离子水补至25 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 m i n，94℃变性30 s，退火30 s（根据引物不同设置不同退火温度），72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃终延伸10 m i n。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

经鉴定BVDV阳性的病料，0.22 μm滤膜过滤后取1 m L接种于M DBK细胞中，并设立对照组，待孵育1 h后，病毒与细胞充分接触，添加6～7 m L营养液。置37℃CO2培养箱中培养4～7 d，逐日观察细胞病变，若7 d仍不出现细胞病变，则回收培养物冻融2次，离心后取上清液接种于新的单层细胞，盲传3代后，观察细胞病变。出现病变者冻融3次后离心收取上清液，保存于-70℃冰箱待鉴定。如果未出现病变，则继续盲传，如还未出现病变，则反复冻融提取病毒RN A。试验同时做BVDV阳性和阴性对照。

提取收集病毒液的RN A，方法参照病毒RN A提取试剂盒（Q IAGEN）说明书。按照M-M u LV反转录试剂盒进行反转录制备cDN A，如上述PCR体系进行鉴定。

1.2.2病毒的蚀斑纯化M DBK铺于6孔板内，将收获的病毒用不含血清的DM EM维持液做10-1～10-6梯度稀释后，接种于6孔板中培养的密度为80%的M DBK细胞上，37℃孵育1～2 h，使病毒充分吸附。将提前灭菌煮沸的低熔点琼脂糖和2×M EM以1:1（v/v）混合后加入到细胞培养板中，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面。待凝固后倒置于37℃培养箱中继续培养。待出现病变后，利用中性红染色。挑取单个的蚀斑置于无血清的DM EM培养液中，反复冻融3～5次，再用于接种M DBK细胞，进行下一轮的蚀斑纯化，如此反复操作3代后得到纯化的病毒。

2 结果与分析

2.1病毒的分离与鉴定3份样品中其中有一份为BVDV阳性，将粪便以及鼻拭子分别接种M DBK细胞，经过3次盲传后，接种粪便的M DBK细胞出现明显细胞病变。经RT-PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，在288 bp处有明显条带，与预期结果一致。

图1接种病料后MDBK细胞病变情况Fig.1Inoculation of MDCK cells

2.2病毒的蚀斑纯化病毒接种细胞后，约4～5 d，显微镜下能看到细胞出现病变，中性红染色后可见透明呈圆形的蚀斑，大小不完全相同，但边缘清晰。细胞病变特征为细胞死亡、变圆、聚集成堆、脱落、脱落的细胞变圆，漂浮在维持液中，并逐渐缩小，活细胞在瓶壁上成拉网状；随着传代次数的增加，出现病变的时间缩短。而未接毒的细胞镜下未见变化，中性红染色后也不出现蚀斑。

3 讨论和结论

本试验采集黑龙江省某牛场疑似感染BVDV患畜的粪便以及鼻拭子，进行样品处理，接种细胞培养，盲传3代后接种粪便的M DBK细胞出现CPE，收毒并提取RN A，进行PCR鉴定，最后通过蚀斑纯化分离病毒。本试验分离到的病毒出现典型CPE，因此分离到的病毒为CP型。

病毒的分离过程中细胞的培养是非常重要的环节，在细胞培养中，对血清的选择是尤其关键的，因为BVDV可以通过胎盘屏障传给胎牛，这可能造成在胎牛血清中含有BVDV抗体，市场上经过处理的血清也有可能含有BVDV残留，聂兆晶等[8]在细胞培养中选用的是马血清，可以避免牛血清中BVDV抗体的干扰。而本试验在细胞培养过程中选取的血清为gi bco胎牛血清，并且从PCR结果中阴性对照中也说明此血清中无BVDV残留。

蚀斑纯化病毒时，将病毒进行不同梯度的稀释接种于M DBK细胞上，病毒在细胞上增殖，对病毒浓度的控制是试验的关键，一个孔中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取蚀斑细胞，将其继续接毒传代3次以上得到纯化病毒。本试验成功分离到BVDV病毒，这为后续病毒基因结构的研究奠定基础。

[1]TAUTZ N,TEW S B A,M EYERS G.The M ol ecul ar Biol ogyofPesti vi ruses[J].Advancesi n vi rus research,2015,93:47-160.

[2]W AN G F I,DEN G M C,H UAN G Y L,et al.Structuresand Functi onsofPesti vi rusGl ycoprotei ns:N otSi m pl y Surface M atters[J].Vi ruses,2015,7(7):3506-3529.

[3]何延华，黄新，钟发刚，等.牛病毒性腹泻病毒基因1型全基因组的测序分析[J].中国兽医科学，2012，42（3）：253-257.

[4]SAYERS R G,SAYERS G P,GRAH AMD A,et al.Impactofthree i nacti vated bovi ne vi raldi arrhoea vi rus vacci nes on bul k m i l k p80(N S3) ELISA test resul ts i n dai ry herds[J].Veterinary j ournal,2015,205(1):56-61.

[5]李树博.牛病毒性腹泻病毒分子生物学特性及流行病学研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2015，3（5）：5-6.

[6]姚伟.辽宁地区规模化奶牛场牛病毒性腹泻-黏膜病血清学调查[J].现代畜牧兽医，2015，5（4）：36-40.

[7]王建领，付彤，刘杰，等.牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展[J].河南农业科学，2012，41（3）：7-11.

[8]聂兆晶，田夫林，姜世金.一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在M DBK细胞上的克隆纯化[J].西北农业学报，2012，21（1）：21-25.

Isolation and identification of Bovine viral diarrhea virus

Bi Yi ng,N i H ongbo*
(H ei l ongj i ang Bayi Agri cul tural Uni versi ty,H ei l ongj i angDaqi ng163319)

W i th suspected bovi ne vi ral di arrhea vi rus di sease m ateri al separati on and i denti fi cati on.In thi s study,cow s of H ei l ongj i ang Provi nce W anda cattl e i nfected w i th bovi ne vi raldi arrhea vi rus w ere di seased acqui si ti on.Speci m ens col l ected w ere i nocul ated by M DBK cel l s and reproduced bl i ndl y 3 generati ons.The vi ralRN A w as am pl i fi ed by PCR i denti fi cati on.Fi nal l y,the coll ected vi rus by pl aque puri fi cati on experi m ents puri fi ed vi rus.Resul t:The vi rus i nocul ati on obvi ous l esi ons on M DBK cel l.PCR am pl i fi ed the expected am pl i fi cati on segm ent.The vi rus w as i sol ated by 3 ti m es pl aque puri fi ed.Concl usi on:Successful l y i sol ated the bovi ne vi raldi arrhea virus.

Bovi ne vi ral di arrhea vi rus;M DBK;Identi fi cati on;The pl aque puri fi cati on

S852.659.6

B

1672-9692(2016)07-0014-03

2016-05-25

毕莹（1993-），女，在读硕士，主要从事分子细菌学和免疫学研究。

倪宏波（1972-），教授，博士生导师，主要从事分子细菌学和免疫学研究。