复方恩诺沙星对畜禽主要病菌体外抑菌试验

2016-11-28曹志梅山西省太谷县畜牧兽医中心030800闫芳山西农业大学动物医学系030801

中国畜禽种业 2016年9期

曹志梅（山西省太谷县畜牧兽医中心 030800）闫芳（山西农业大学动物医学系 030801）

复方恩诺沙星对畜禽主要病菌体外抑菌试验

曹志梅（山西省太谷县畜牧兽医中心 030800）闫芳（山西农业大学动物医学系 030801）

采用纸片扩散法 (K-B法)测定复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的敏感性大小，采用试管倍比稀释法测定复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度 (MBC)。结果表明，病原性大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄菌、鸡巴氏杆菌、猪巴氏杆菌、链球菌对复方恩诺沙星可溶性粉敏感，复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.0279～3.575μg/ml，最小杀菌浓度为（MBC）为 0.055～7.11μg/ml。

复方恩诺沙星；可溶性粉；化学抗菌药；最小抑菌浓度（MIC）；最小杀菌浓度（MBC）；畜禽主要病菌；体外；抑菌试验

复方恩诺沙星可溶性粉主要成分为恩诺沙星和乙酰甲喹。恩诺沙星于1983年由公司合成，因其抗菌广谱、安全性高而被广泛应用于兽医临床[1-3]。恩诺沙星是第一种畜禽专用的氟喹诺酮类药物，抗菌谱广，杀菌活性强，对革兰氏阴性菌和阳性菌、细胞内病原菌、支原体及一些耐药菌株有很强的抗菌活性。其通过抑制细菌的DNA合成酶中的回旋酶达到杀菌作用，同时本品对细菌细胞膜具有损伤作用，可以使细菌的内容物流失而导致细菌死亡，双重杀菌作用。乙酰甲喹又名痢菌净，化学名称为3-甲基-2-乙酰基-N-1，4-二氧喹噁啉，是中国农业科学院中兽医研究所研制的化学抗菌药，具有较广的抗菌谱和较强的体内外抗菌活性。兽医临床上主要用于治疗猪痢疾及畜禽消化道细菌感染。本实验通过测定恩诺沙星对畜禽主要致病菌的敏感性大小、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），拟为临床治疗疾病时制定更为合理的方案提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

试验菌株种类，见表1。

1.1.2 供试药物

复方恩诺沙星可溶性粉，山西奥福莱动物药业有限公司，生产批号040502，200g，恩诺沙星12g，乙酰甲喹20g。

1.1.3 培养基

MH琼脂培养基，MH肉汤培养基，鲜血MH琼脂培养基，血清MH肉汤培养基。

1.1.4 试验仪器

定性试纸，试管，培养皿，打孔器，镊子，无菌棉，酒精灯，温箱。均由本试验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 药敏纸片制备

表1 抑菌试验用菌株

取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6.25mm直径的圆形小纸片。取圆纸片100片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15～20min高压灭菌后，放在37℃温箱或烘箱中1～2d，使完全干燥。在上述含有100片纸片的青霉素瓶内加入药液0.7ml，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。放37℃温箱内干燥后即加盖密封，切勿受潮，置阴暗干燥处存放备用[4-6]。

1.2.2 试验菌液制备

从培养了16～24h的斜面上挑取菌落于灭菌生理盐水中，并将其悬液浊度调至0.5号麦氏标准管，直接用此盐水悬液作为接种物，菌量约1×108cfu/ml[7-9]。

1.2.3 供试药液配制

精确称取1g药物先加入0.1mol/L的NaOH溶液10ml，再加入pH7.2的PBS液32ml，混匀[10]。

1.2.4 K-B纸片法

用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，并在管壁上拧压除去多余菌液后置于培养基平板表面反复推涂，以保证细菌在平板表面均匀分布，盖上平皿盖在室温干燥3～5min，用无菌镊子或纸片分配器放置药敏纸片，各纸片中心距不小于24mm，纸片据平板内缘应大于15mm。贴完纸片后，在15min内将平板反转过来，置于温箱中，培养24h后观察结果[11]。

1.2.5 试管倍比稀释法

药物的浓度按倍比稀释来建立，试验要在无菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中取10支试管排成一列，在第1管中加入1ml药液和1ml灭菌肉汤。第2～10管均加入1ml灭菌肉汤。第1管混匀后取1ml的量加入到第2管中，混匀后从第2管中取1ml的量加入到第3管中，依次类推到第10管，混匀后取1ml的量弃掉。另取两管分别加入1ml灭菌肉汤和而不加药物，其中一管作为细菌生长情况对照，另一管作为空白对照。将2.2.2中制备好的试验菌液加入到第1～11管中，每管加入量为0.1ml，35℃培养16～24h后肉眼观察，呈明显不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小抑菌浓度（MIC）；继续培养至48h，肉眼观察呈不混浊的试管所含最小的药物浓度为最小杀菌浓度（MBC）[12-13]。

2 试验结果

K-B纸片法试验结果，见表2。最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度 (MBC)试验结果，见表3。

表2 K-B纸片法试验结果

3 讨论

3.1 影响药敏试验结果的因素

药敏试验结果易受抗菌药物纸片含药量、培养基、接种细菌菌量、培养时间等因素的影响。

抗菌药物纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素，而纸片含药量又与纸片的重量、吸水性、直径等有关，首先制备药敏纸片应选则合格纸片，要求所用滤纸的吸水性好，均匀，不含无关的化学物质和色素等，直径为6.25 mm，制备药敏纸片时药物应称量准确，药液应摇匀，浸泡应充分，制备好的纸片应妥善保存，保存条件以低温干燥为佳，最好保存于-20℃，以防药力降低。药敏纸片制备后立即用标准敏感菌株作敏感试验，并记录其抑菌圈直径，每次用前应复查1次。

药敏试验强调使用专门培养基MHA，但考虑到本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌（购自中监所），为了能够使多种细菌都能生长发育良好，有些细菌如沙门氏菌、巴氏杆菌和链球菌等特选用了鲜血MH琼脂培养基，血清MH肉汤培养基。制备K–B法培养基厚度应为4mm，平皿用直径90mm的较好。据报道，做药敏试验的培养基厚度相差2mm，抑菌圈直径最大也会相差2mm，为了防止因培养基厚度而造成的试验误差，应严格控制每个琼脂平板的厚度，用直径为90mm的平皿倾注约15m1普通营养琼脂液体，保证琼脂厚度为4mm。

表3 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度(MBC)试验结果

接种菌量应稀释到浓度为0.5麦氏比浊管，相当于1×108cfu/ml，若菌稀释倍数偏高，菌液浓度偏低，导致接种菌量太少，虽然菌性不变，但抑菌圈直径常增大，易将耐药药物误判为敏感药物，相反，若菌料稀释倍数偏低，菌液浓度偏高，导致接种菌量太多，抑菌圈直径常变小，有可能将敏感药物误判为耐药药物。

细菌培养时间。细菌培养时间过长，细菌能恢复生长，使抑菌圈变小，培养时间过短，抑菌圈还未最终形成，这都可能影响药敏试验结果的判定，有可能将敏感药物与耐药药物混淆，因此测定了细菌培养时间，分别制定了不同病原菌观察结果最佳时间。

总之，在试验操作的各个环节中都应严格按照试验要求进行，尽可能地避免系统误差，减小随机误差，以提高试验数据的可信度。

3.2 结果分析

药敏试验的目的是对抗生素临床治疗效果进行预测，查出耐药性，减少治疗错误，同时可以根据敏感、中介、耐药的提示结合MIC可以方便地制定用药方案。药敏试验时，正确选择病原菌显得更为重要，本试验所用的试验菌株均来自发病畜禽体内分离的病原菌，可以有效反映复方恩诺沙星可溶性粉的抗菌谱，结果表明其对来源于鸡及猪的病原性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄菌、鸡巴氏杆菌、猪巴氏杆菌、病原性链球菌均敏感，对鸡沙门氏菌不敏感，复方恩诺沙星可溶性粉对畜禽主要致病菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.0279～3.575μg/ml，最小杀菌浓度为（MBC）为 0.055～7.11μg/ml。

药敏试验是一种体外试验，细菌在体外对抗生素耐药，在体内也会耐药，而在体外敏感的体内就不一定敏感，所以耐药是药敏试验的正结果。因此，在预侧体内结果时，耐药的结果可以确信，而敏感的应保持怀疑。虽然药敏试验是药物在体外的抑菌试验，结果能否完全代表药物在动物体内的动力学代谢过程及药物在动物体内的抑菌效果有待进一步研究，但可以从侧面提供用药的依据，指导生产及时准确地控制细菌性疾病。

有条件的养殖场最好开展细菌耐药性监测。用药物之前最好先做药敏试验。用药要科学合理，剂量要足，疗程要够，防止药物浓度达不到杀菌浓度而使细菌产生耐药性。尽量减少预防性投药，不滥投药，尽量交换用药，并注意联合用药，防止交叉耐药性的产生。搞好消毒，防止耐药菌株的扩散。