我国局部猪胸膜肺炎流行调查和血清型分析

2016-11-28马爽于国营郭莉莉宋新宇程增青郭玉广范根成易邦生物工程有限公司266114

中国畜禽种业 2016年4期

马爽于国营郭莉莉宋新宇程增青郭玉广范根成（易邦生物工程有限公司 266114）

我国局部猪胸膜肺炎流行调查和血清型分析

马爽于国营郭莉莉宋新宇程增青郭玉广范根成（易邦生物工程有限公司 266114）

为了解我国猪传染性胸膜肺炎的流行情况及其病原胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleurnopneumoniae，简称APP）的主要血清型，1990年～2014年我们对我国23省市不同养猪场进行了流行病学调查。调查结果表明，该病在我国23个省市均有发生，先后从山东、深圳、上海、河北、江苏、河南等省、市的临床病例和送检病料中分离到APP病原62株，其中已鉴定、定型的菌株59株，所涉及的型株为1型4株、2型11株、3型3株、5型18株、7型19株、8型1株、未定型3株。根据我们对全国流行病学调查和病原分离鉴定各型分离株的多少及其毒力的强弱比较分析，本病危害我国养猪业发展的主要血清型为7型、5型和1型。

猪；传染性胸膜肺炎；流行病学调查；血清型；我国局部地区

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种接触性传染病，是猪的一种重要呼吸道疾病，在许多养猪国家流行，已成为世界性工业化养猪的五大疫病之一[1]，在我国1988年农业部青岛动检所朱士盛等人从403份加拿大进口猪血清中检出23头APP阳性猪[2]。为了解其流行情况，故开展了此次流行病学调查并进行了分析。流行病学调查结果如下。

1 材料

1.1 病料

采集山东、深圳、上海和河南等省市发病死亡猪肺、气管、肺门淋巴结等组织。

1.2 菌株

APP1～9型国际参考株由瑞士伯恩大学兽医细菌研究所J.Nicolet教授惠赠，APP10～12型国际参考株由丹麦兽医学血清实验室R.Nielsen博士惠赠；鸡表皮葡萄球菌由澳大利亚Bendego地区兽医研究所惠赠。

1.3 阳性血清和抗原

APP1～12型阳性血清和ELISA抗原，均由青岛易邦生物工程有限公司制备。

1.4 培养基

血琼脂、S琼脂、S肉汤等培养基均由青岛易邦生物工程有限公司制备。

1.5 微量生化鉴定管

购自杭州微生物试剂有限公司。

1.6 PCR检测引物

上游引物:5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’，下游引物:5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’，产物大小约为442bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 PCR检测试剂

rTaq酶等PCR检测试剂套装、DL2000Marker等PCR检测试剂购自TaKaRa。其它试剂均为国产分析纯。

1.8 试验猪

5～6周龄健康易感仔猪购自青岛平度某健康猪场（APP1～12型ELISA抗体均为阴性）。

2 流行病学调查

2.1 血清学调查

1990～2014年，我们对我国部分省市无猪传染性胸膜肺炎疫苗免疫背景的杂交猪血样抽检进行了血清学调查，采用ELISA试验方法进行检测。

2.2 病原学调查

2.2.1 细菌分离

采集发病猪鼻腔分泌物，或病死猪肺、气管、肺门淋巴结等组织，分别接种于S琼脂培养基上，置5～10%CO2条件下， 37℃培养 16～18h。

2.2.2 细菌鉴定

（1）形态观察。挑取疑似菌落涂片经革兰氏染色，置显微镜油镜下观察其形态。然后将疑似菌落纯化培养，进行下列试验。

（2）生化特性。挑取疑似菌落按常规方法进行溶血性试验、 “卫星现象”、CAMP试验、尿素酶试验；糖发酵试验，包括葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇、乳糖、阿拉伯胶糖及棉子糖，试验中同时用Shope4074株参考株作对照，于37℃培养24～48h，观察结果。

（3）分子生物学鉴定。分别将分离菌株的16～18hS肉汤培养物经过热处理制备PCR模板。利用上游引物:5’-TGGCACTGACGGTGATGA-3’，下游引物:5’ -GGCCATCGACTCAACCAT-3’进行PCR鉴定。

（4）血清学特性鉴定。应用琼脂扩散试验方法进行血清学特性鉴定。

（5）部分分离株的动物回归试验。取分离株HT株（血清1型）、SZ株（血清5型）、DY株（血清7型）、SZ4株（血清2型）进行动物回归试验。分别将分离菌株的16～18hS肉汤培养物3ml滴鼻攻击5～6周龄健康易感仔猪，每株攻毒菌液的活菌量分别调节约为1×106CFU/头、1×107CFU/头和5×107CFU/头，每个菌株的不同剂量组均攻击5头仔猪，另设同条件对照5头，观察14日内攻毒仔猪发病情况。

3 结果

3.1 猪传染性胸膜肺炎血清学调查结果

1990～2014年对我国部分省市杂交猪进行了的血清学调查，调查结果见表1。

3.2 病原学的调查结果

3.2.1 细菌分离

从23个省市50多个发病猪场，采集132份病料进行细菌分离，共分离到疑似猪胸膜肺炎放线杆菌62株。

3.2.2 细菌鉴定

（1）形态观察。分别挑取分离菌62株培养16～18h疑似菌落，经革兰氏染色镜检均为阴性，呈小杆菌、球杆菌，也可见丝状菌体等多形态。

（2）生化特性。经纯化培养的62株疑似菌株经溶血性试验、 “卫星生长现象”、CAMP试验、尿素酶试验均为阳性，均能发酵葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露醇，不发酵乳糖、阿拉伯胶糖、棉子糖。

（3）培养特性。所有分离菌株在含有V因子和灭活鸡血清的S肉汤培养基中生长呈均匀一致混浊。所有分离菌株接种于S琼脂培养基上于5～10%CO2条件下，37℃培养16～18h，形成直径达1mm左右，圆形、边缘整齐、半透明呈露珠状的灰白色菌落，于折射光下观察具有虹彩光泽。在普通营养琼脂培养基上不生长。

表1 我国23个省、市杂交猪APP血清学调查结果

（4）分子生物学鉴定。分别制备62株分离菌株模板进行PCR检测，均能扩增出长约442bp的特异性DNA片段。部分分离菌株电泳图像如图1所示。

图1 部分分离菌株PCR鉴定结果

（5）血清学特性鉴定。对62株分离株进行血清学特性鉴定，结果其中3株未能定型，已定型的59株中包括血清1型4株、血清2型11株、血清3型3株、血清5型18株、血清7型19株、血清8型1株。结果见表2。

表2 1990～2014年我国APP分离菌及型株鉴定统计表

3.2.3 部分分离株动物回归试验

HT株 1×107CFU/头、 5×107CFU/头剂量组均能使攻毒仔猪全部发病，SZ株和DY株只有5×107CFU/头剂量组能使攻毒仔猪全部发病，所有发病猪的临床表现为呼吸加快，采食量下降，体温升高0.5℃以上，持续1～5d；死亡猪从口鼻腔流出带红色泡沬样血水，剖检见胸腔、心包内积液、肺肿大出血、肺表面附有纤维素性渗出，并与胸腔发生粘连（如图2如示）；而SZ4株各攻毒组仔猪均未发病，未呈现临床症状，剖检均无明显病变（如图3所示）；对照猪均未发病，剖检各脏器均正常。

图2 攻毒发病猪肺

4 讨论与分析

（1）哈尔滨兽医研究所于1987年发现临诊病例，并通过病原分离鉴定、病原菌血清分型、人工复制病变及血清学检查等，证明App在我国的存在和流行，杨旭夫于1990年对此进行了报道[3]。此后陆续许多省市都有关于发病的报道。通过我们对本病血清学调查结果表明本病已在我国各规模化养猪场普遍存在，而且血清阳性检出率逐年具有上升趋势。1990～2014年对我国23个省市的杂交猪35474份血样检测结果阳性4663头，阳性率平均为13.1%。

（2）我们在猪传染性胸膜肺炎病原学调查中获得APP分离株62株，其中59株已经定型，根据我们对我国部分省市进行的流行病学调查，病原的分离鉴定、定型[4]和毒力试验结果认为，当前给我国养猪业发展带来危害的猪传染性胸膜肺炎的主要流行型为7型、5型和1型，应引起养殖界和研究学者们的关注。