Preso调控nNOS在神经元机械性损伤中的作用

岳康异 杨甜 李新 杨悦凡 戴舒惠 马文科 蒋晓帆 罗鹏

(第四军医大学：1西京医院神经外科，2学员一旅;3西京医院麻醉科，陕西 西安 710032；4西安交通大学医学部，陕西 西安 710061)

·论著·

Preso调控nNOS在神经元机械性损伤中的作用

岳康异1,4杨甜1,2李新3杨悦凡1戴舒惠1马文科1蒋晓帆1罗鹏1*

(第四军医大学：1西京医院神经外科，2学员一旅;3西京医院麻醉科，陕西 西安 710032；4西安交通大学医学部，陕西 西安 710061)

目的通过建立神经元机械性损伤模型，研究突触后致密物质(PSD)支架蛋白中的树突棘突触后致密物质-95(PSD-95)相互作用调节蛋白(Preso)在创伤性脑损伤中的作用及调控机制。方法建立神经元机械性损伤模型，通过细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)检测神经元损伤程度，并通过Western blot检测明确Preso在损伤后的表达变化；利用Preso慢病毒过表达载体上调Preso在神经元中的表达，通过细胞活力和LDH检测明确上调Preso在神经元损伤中的作用；利用神经元特异性一氧化氮合酶(nNOS)特异性抑制剂ARL 17477，通过细胞活力和LDH检测明确抑制nNOS对上调Preso调控神经元损伤的影响。结果神经元机械性损伤后，Preso表达无明显改变，而上调Preso表达可加重神经元损伤；利用nNOS特异性抑制剂ARL 17477可显著改善神经元损伤，并抑制上调Preso表达对神经元损伤的影响。结论神经元机械性损伤后，Preso可促进神经元损伤的形成，而nNOS是其重要的下游效应分子。

创伤性脑损伤; 突触后致密物质; 支架蛋白; 神经元特异性一氧化氮合酶

世界卫生组织的报告显示，外伤是导致人群死亡或丧失正常生活能力的主要原因。在众多外伤性疾病中，创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的致残、致死率最高，给伤者个人、家庭及社会带来极大的负担，是世界范围内亟待解决的公共卫生问题[1]。突触后致密物质(postsynaptic density,PSD)是神经元突触后膜上一系列蛋白的统称，包括谷氨酸受体、支架蛋白、信号转导分子等上百种分子，与兴奋性毒性损伤的调控密切相关[2]。大量的研究表明，PSD支架蛋白参与TBI后神经元损伤的调节，是潜在的TBI治疗关键点。

突触后支架蛋白树突棘突触后致密物质-95(PSD-95)相互作用调节蛋白(PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis,Preso)是一种包含多个蛋白质相互作用结构域的PSD支架蛋白，可以同时连接谷氨酸受体及其他PSD支架蛋白，进而参与突触功能调控[3]。我们的前期研究证实，Preso可通过差异性调节代谢性谷氨酸受体和离子型谷氨酸受体的功能，影响神经元兴奋性毒性损伤，提示其可作为神经元保护的重要靶点[4]。在前期研究基础上，本研究利用机械性神经元损伤模型在离体神经元上模拟TBI，旨在探讨Preso在TBI后神经元损伤中的作用及机制。

材料与方法

一、材料

孕14～16 d 昆明小鼠购自第四军医大学实验动物中心；Preso抗体购自美国Ramp;D公司；β-actin抗体购自美国CST公司；山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗均购自北京鼎国公司；神经元特异性一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)特异性抑制剂ARL17477购自英国Tocris公司；神经元基质培养基(neurobasal)、B27、10%胎牛血清、改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)均购自美国Gibco公司；多聚赖氨酸、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)均购自美国Sigma公司；Preso慢病毒过表达载体(lentiviral vector-Preso,LV-Preso)、慢病毒对照载体(lentiviral vector-control,LV-Con)均购自上海吉凯公司；细胞活力检测试剂盒、蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)、苯甲基磺酞氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、凝胶电泳试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白定量试剂盒购自北京博奥森生物技术公司。

二、方法

1.小鼠脑皮层神经元原代培养：孕14～15 d昆明小鼠，常规处死后在无菌状态下快速取出小鼠胚胎，在解剖显微镜下剥离小鼠胚胎大脑皮层。剪碎脑皮层，加入胰蛋白酶并置于37℃、5% CO2孵箱中消化20 min。在室温下加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化10 min，并在含10%胎牛血清的DMEM培养液中将组织块吹打成细胞悬液。室温静置5 min，显微镜下计数，以2.5×105个细胞/cm2将细胞接种于6孔和96孔细胞培养板，神经元体外培养2 w后备用。

2.体外培养神经元机械性损伤：以10 μl的微量移液器塑料枪头于6孔板内划割，造成神经元机械性损伤，划伤道宽度为1 mm，两相邻划伤道间隔4 mm。依据预先在培养皿底面画好的标记线(9×9)划割培养好的神经元，标记线均匀分布在培养皿底面，保证同一组内的神经元损伤程度和范围一致。

3.神经元转染：转染前6 h对神经元换液，按照1×105TU/ml的浓度分别加入LV-Preso和LV-Con，转染48 h后在显微镜下观察转染效率，72 h后可进行实验分组操作。

4.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定：每培养皿收集100 μl培养基用于LDH活性测定，方法按照试剂盒说明书操作，反应结束后在440 nm测定样品吸光度计算LDH活性。标准以每克乳酸脱氢酶蛋白37℃与基质作用15 min，反应体系中产生1 μmol丙酮酸记为1 U LDH活性。

5.蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达：将损伤区域脑组织加入蛋白裂解液后在冰上进行匀浆，完成后将组织匀浆离心30 min，取上清液进行蛋白定量检测，并制备成Western Blot样品。常规电泳，Preso一抗(1∶800)、β-actin一抗(1∶1 500)，显色压片后使用扫描仪采集电子图像信息进行分析。

6.统计学分析：实验数据采用均数士标准误表示，通过GraphPad Prism software version 5.0对获得的数据进行统计。多区间数据比较采用双因素方差分析(ANOVA)，若总体差异显著，再以t检验分析相应两组间的显著性差别。以Plt;0.05为有显著性差异。

结 果

一、神经元机械性损伤后Preso的表达变化

在不同时间点对离体神经元进行机械性损伤，细胞活力检测结果显示，神经元细胞活力随损伤时间延长不断降低(图1A)；LDH检测结果显示，LDH释放含量随损伤时间延长不断增加(图1B)；这些结果提示机械性神经元损伤模型造模成功。Western blot结果显示，与对照组相比，损伤后6 h、12 h、24 h神经元中的Preso表达未见明显变化(图1C)，提示Preso在损伤后稳定表达。

二、Preso在神经元机械性损伤中的作用

利用LV-Preso和LV-Con对神经元进行转染，72 h后建立机械性神经元损伤模型。Western blot结果显示，LV-Preso转染组与LV-Con组相比，Preso表达明显上调(图2A)；细胞活力检测结果显示，上调Preso表达显著降低损伤后神经元细胞活力(图2B)；LDH检测结果显示，上调Preso表达显著升高LDH释放量(图2C)。这些结果提示，Preso可促进机械性神经元损伤的形成。

三、nNOS在Preso调控神经元机械性损伤中的作用

利用LV-Preso和LV-Con对神经元进行转染，72 h后建立机械性神经元损伤模型，并给予nNOS特异性抑制剂ARL 17477(10 μM)。细胞活力检测和LDH检测结果显示，与DMSO组相比，ARL 17477可明显改善神经元活力、减少LDH释放(图3)。然而，给予ARL 17477后，LV-Con组与LV-Preso组相比在细胞活力、LDH释放上并无显著差异(图3)。以上结果提示，抑制nNOS活性可在神经元机械性损伤后发挥保护作用，并明显抑制Preso对神经元损伤的影响，表明nNOS在Preso调控神经元机械性损伤中发挥重要作用。

图1 神经元机械性损伤后细胞活力、LDH释放及Preso表达的变化
Fig 1 Alterations of cell viability,LDH release,and Preso expression after neuronal mechanical injury
A:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability at 6 h,12 h,and 24 h after injury;B:LDH assay showed a significant elevation of LDH release at 6 h,12 h,and 24 h after injury;C:Western blot did not show a significant change of Preso expression after injury.
aPlt;0.05,vsCon.

图2 上调Preso对神经元机械性损伤的影响
Fig 2 Effects of Preso up-regulation on neuronal mechanical injury
A:Western blot showed a significant elevation of Preso expression in LV-Preso group;B:Cell viability assay showed a significant reduction of cell viability in LV-Preso after injury;C:LDH assay showed a significant elevation of LDH release in LV-Preso after injury.
aPlt;0.05,vsLV-Con.

图3 nNOS抑制ARL 17477对Preso调控神经元机械性损伤的影响
Fig 3 Effects of ARL 17477,a nNOS inhibitor,on regulation of neuronal mechanical injury by Preso
A:Cell viability assay showed a significant elevation of cell viability in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment;B:LDH assay showed a significant reduction of LDH release in ARL 17477 group,but no significant difference between LV-Con group and LV-Preso group after ARL 17477 treatment.
aPlt;0.05,vsDMSO;bPlt;0.05,vsLV-Con.

讨 论

PSD支架蛋白是PSD分子网络的重要组成部分，一方面可通过PSD-95/Dlg/ZO-1(PDZ)结构域(例如PSD-95)聚集PSD蛋白，发挥稳定PSD结构的作用；另一方面，PSD支架蛋白(例如Homer、Shank)通过相互连接形成一种分子网状支架结构，为PSD中的受体和信号转导蛋白提供作用平台，调节PSD功能[5]。早期的研究发现，TBI后PSD支架蛋白PSD-95、Homer1a及Homer1b/c表达均有所变化，提示TBI后突触结构发生改变。而近期的研究表明，PSD-95抑制剂ZL006可显著降低TBI后脑水肿反应，改善神经功能，并抑制TBI后损伤灶周边的氧化应激反应[6]。此外，上调Homer1a或下调Homer1b/c能够减轻TBI及兴奋性毒性损伤引起的神经元凋亡、脑组织破坏及神经功能障碍[7,8]。以上结果证实，PSD支架蛋白不但是TBI后突触结构改变的标志蛋白，同时也可作为潜在的功能性分子参与TBI病理过程。

Preso是一种包含多个蛋白质相互作用结构域的PSD支架蛋白，可以同时连接PSD-95、mGluR和Homer，进而参与突触结构与功能调节。研究表明，Preso羧基末端的PDZ结合结构域可直接与PSD-95的PDZ结构域相连，从而为PSD-95及其连接的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)提供了分子作用平台，使其构成的NMDAR/PSD-95复合体在发挥调节突触结构和功能的作用[4]。我们前期的研究发现，下调Preso在神经元中的表达，可明显减轻神经元谷氨酸兴奋性毒性损伤，其具体机制与抑制NMDAR受体引起的Ca2+超载密切相关[5]。本研究证实，上调Preso在神经元中的表达，可加重神经元机械性损伤，进一步说明Preso可直接参与TBI后神经元损伤的形成，而其作用机制与Preso调控NMDAR/PSD-95复合体下游信号密切相关。

PSD-95可通过2个不同的PDZ结构域分别和NMDA受体及nNOS相结合，形成NMDAR/PSD-95/nNOS复合体，发挥促进氧化应激的作用。TBI后，nNOS选择性结合环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)，通过亚硝基化激活COX-2，从而参与NMDAR介导的神经毒性[9]。除NO外，线粒体内Ca2+水平上调可引起包括超氧阴离子自由基在内的ROS的产生。NO与ROS结合会形成具有高硝化活性的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)。研究表明，TBI可产生大量的ONOO-，从而引起蛋白质硝基化、脂质过氧化和DNA断裂，最终引起神经细胞大量死亡[10]。本实验发现，nNOS特异性抑制剂可有效抑制上调Preso所引起的神经元过度损伤，证实nNOS是TBI后Preso调控NMDAR/PSD-95复合体的关键下游效应分子。

本实验以PSD支架蛋白Preso为切入点，证实其在TBI后发挥促进神经元损伤的作用，并进一步探讨了nNOS作为其重要效应分子在TBI中发挥关键调控作用。这些研究结果不但丰富了TBI的分子病理机制，同时为有效干预TBI后神经元损伤提供了关键靶点。

1Rubiano AM,Carney N,Chesnut R,et al. Global neurotrauma research challenges and opportunities [J]. Nature,2015,527(7578):S193-197.

2Sheng M,Hoogenraad CC. The postsynaptic architecture of excitatory synapses:a more quantitative view [J]. Annu Rev Biochem,2007,76:823-847.

3Lee HW,Choi J,Shin H,et al. Preso,a novel PSD-95-interacting FERM and PDZ domain protein that regulates dendritic spine morphogenesis [J]. J Neurosci,2008,28(53):14546-14556.

4Luo P,Yang Y,Liu W,et al. Downregulation of postsynaptic density-95-interacting regulator of spine morphogenesis reduces glutamate-induced excitotoxicity by differentially regulating glutamate receptors in rat cortical neurons [J]. FEBS J,2013,280(23):6114-6127.

5Hayashi MK,Tang C,Verpelli C,et al. The postsynaptic density proteins Homer and Shank form a polymeric network structure [J]. Cell,2009,137(1):159-171.

6蒋子剑,杨甜,马文科,等. ZL006阻断PSD-95信号途径调节线粒体功能在创伤性脑损伤中的作用 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2015,14(6):519-522.

7Luo P,Chen T,Zhao Y,et al. Postsynaptic scaffold protein Homer 1a protects against traumatic brain injury via regulating group I metabotropic glutamate receptors [J]. Cell Death Dis,2014,5:e1174.

8王远,费舟,黄卫东,等. 下调Homer-1b/c基因对机械性损伤神经元存活率的影响 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2010,9(2):101-104.

9Tian J,Kim SF,Hester L,et al. S-nitrosylation/activation of COX-2 mediates NMDA neurotoxicity [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(30):10537-10540.

10Lau A,Arundine M,Sun HS,et al. Inhibition of caspase-mediated apoptosis by peroxynitrite in traumatic brain injury [J]. J Neurosci,2006,26(45):11540-11553.

EffectsofPresoonregulationofnNOSafterneuronalmechanicalinjury

YUEKangyi1,3,YANGTian1,2,LIXin4,YANGYuefan1,DAIShuhui1,MAWenke1,JIANGXiaofan1,LUOPeng1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,2FirstTroopsofUndergraduateStudents,3DepartmentofAnesthesiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032;4CollegeofMedicine,Xi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

ObjectiveThe role of postsynaptic density (PSD) scaffold protein PSD-95 interacting regulator of spine morphogenesis (Preso) in traumatic brain injury via establishment of neuronal mechanical injury model was investigated.MethodsAfter neuronal mechanical injury,neuronal injury was detected by cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) assay;expression of Preso was detected by Western blot. After up-regulating Preso expression in neurons by transfection of lentiviral vector,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay. After administration of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) specific inhibitor,ARL 17477,neuronal injury was detected by cell viability and LDH assay.ResultsAfter neuronal mechanical injury,expression of Preso did not change. Overexpression of Preso reduced the neuronal injury. Neuronal injury was reversed by using ARL 17477. ARL 17477 suppressed the effects of Preso overexpression on neuronal injury.ConclusionPreso promotes the neuronal injury after neuronal mechanical injury and nNOS acts as an important downstream factor of Preso.

Traumatic brain injury;Postsynaptic density;Scaffold protein;Neuronal nitric oxide synthase

1671-2897(2016)15-510-04

R 651

A

国家自然科学基金资助项目(81301037,81371447)；陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4200)；中国博士后基金资助项目(2015M572683)

岳康异，本科， E-mail:176214964@qq.com

*通讯作者：罗鹏，讲师、主治医师， E-mail:pengluo@fmmu.edu.cn

2016-07-08；

2016-10-10)