犬脑积水模型的建立与评估

赵东升 蒋晓帆 姬西团 费舟 贺晓生 孙钢锋 段飞 王正君

(1第四军医大学西京医院神经外科,陕西 西安710032; 2咸阳市第一人民医院神经外科，陕西 咸阳712 000)

·论著·

犬脑积水模型的建立与评估

赵东升1蒋晓帆1姬西团1费舟1*贺晓生1孙钢锋1段飞2王正君1

(1第四军医大学西京医院神经外科,陕西 西安710032;2咸阳市第一人民医院神经外科，陕西 咸阳712 000)

目的对比两种方法建立犬脑积水模型并进行评估。方法选取40只成年犬随机分为实验组、对照组，实验组使用硅油注入第四脑室，对照组使用白陶土注入第四脑室，术前、术后均行头部CT检查确认。结果实验组成功获得脑积水模型15例(75%)，对照组成功获得脑积水模型8例(40%)，两组成功率差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论经枕大池穿刺注射硅油建立的脑积水模型简便易行、重复性和稳定性好，适用于脑积水的实验研究。

犬; 脑积水模型; 白陶土; 硅油

脑积水发病率高，严重影响患者生活质量，甚至危及生命。虽然治疗脑积水方法多样，但远期疗效不理想。研究脑积水的发病机理及治疗方法必须要有一个成熟的脑积水模型，虽然脑积水模型制作方法多样，但哪种方法的可重复性、稳定性更高，仍需进一步探讨。本研究选取40只成年犬通过两种不同方法制备犬脑积水模型，总结制备经验，现报告如下。

材料与方法

一、实验动物与材料

健康1～3岁杂种犬40只(雌性20只，雄性20只)，体重12～16 kg，由第四军医大学西京医院实验动物中心提供。随机分为实验组和对照组，每组20只。64层螺旋CT及配套软件(西门子Definition AS 64,德国)；Fluid 200型硅油(道康宁公司,美国)；陆眠宁Ⅱ(吉林省华牧动物保健品有限公司)；白陶土(浙江三鼎科技有限公司)。

二、实验方法

犬常规行颅脑CT薄层扫描及神经功能检查，排除先天性脑室扩大或神经功能异常。术前禁食水12 h。陆眠宁Ⅱ(0.08～0.1 ml/kg)臀大肌注射麻醉，呈俯卧位，颈部前屈用头架固定头部，头颈部备皮，常规消毒铺巾。自枕外粗隆至第2颈椎棘突做直切口长约10 cm，暴露枕骨大孔及寰椎后弓，咬除1 cm寰椎后弓及1 cm枕骨大孔，暴露寰枕筋膜，正中切开寰枕筋膜约5 mm，见透明蛛网膜，剪开蛛网膜可见清亮脑脊液流出，将细硅胶管置入第四脑室内(深度约1～1.5 cm)。经硅胶管缓慢放出脑脊液约2 ml后，实验组向四脑室注入硅油2 ml后用明胶海绵、耳脑胶封闭；对照组向四脑室注入25%白陶土混悬液2 ml后用明胶海绵、耳脑胶封闭。逐层缝合肌肉层及切口，术后禁食24 h。术中若犬烦躁不安，追加1/2初始计量。术后当天使用一次抗生素。

三、观察指标

1.行为学观察及神经功能评分：术后观察实验动物饮食、意识状态、步态和对刺激的反应,用改良Tarlov 评分标准(0级：下肢完全瘫痪；1级：可觉察的下肢关节运动；2级：下肢可自由运动，但无法站立；3级：可站立但无法行走；4级：下肢运动功能完全恢复，能正常行走)[1]对其神经功能进行评分。

2.CT评价：分别于术后7 d、14 d及60 d 行犬头CT检查,通过室间孔冠状切面的CT图像计算Evan's 比率=脑室宽度/大脑宽度，评价脑室扩张程度[2]。

四、统计学方法

采用SPSS 11.5 统计软件包进行卡方检验。 数据以均数±标准差表示，组间、组内比较采用单因素方差分析，P值lt;0.05 为有统计学意义。

结 果

一、术后存活情况

实验组2只犬术后5～8 h死亡，1只犬清醒后一直不思饮食，于术后3 d死亡，解剖发现脑积水未形成；1只犬术后进食较少，行走不稳，精神萎靡，于术后9 d死亡，解剖发现脑积水形成；2只犬分别于术后17 d、25 d死亡，解剖发现脑室、脑室周围脑组织均有炎性细胞浸润。对照组2只犬于术后10～15 h死亡，1只犬术后持续癫痫，于术后18 h死亡；1只犬清醒后不思饮食，于术后6 d死亡，解剖未见脑积水形成；1只犬清醒后持续共济失调、少量饮食，于术后12 d死亡，解剖未见脑积水形成；2只犬术后 出现共济失调、食欲减退，分别于术后18 d、23 d死亡，解剖见脑室周围脑组织有炎性细胞浸润，脑积水未形成(表1)，两组存活例数之间无统计学差异(Pgt;0.05)。实验组成功形成脑积水模型15例(75%)，对照组为8例(40%)，两组成功率对比有统计学差异(Plt;0.05,表2)。

二、脑积水模型成功例率对比(表2)

表1 术后存活例数(例数)
Tab 1 Survival cases after operation (n)

GroupnTime1d7d14d60d Experimental2018171614 Control2017a16a15a13a

aPgt;0.05,vsexperimental group.

表2 脑积水模型例数对比(%)
Tab 2 Comparison of hydrocephalus model cases (%)

GroupnSuccessFailure Experimental2015(75%)a5(25%) Control208(40%)12(60%)

aPlt;0.05,vscontrol group.

三、行为学观察及神经功能评分

两组均有犬于术后1～4 d开始出现反应迟钝、淡漠、少食或拒食拒饮、嗜睡等症状，上述症状于术后7～9 d左右均有不同程度缓解。进食后有6只发生呕吐，于1 w内缓解。部分出现共济失调。改良Tarlov评分显示：相同时间点实验组与对照组成功形成脑积水模型犬之间差异无统计学意义(Pgt;0.05,表3)。

四、CT评价

两组脑积水成功模型中术后7～60 d均见侧脑室、第三脑室较术前有不同程度扩大(图1)。实验组与对照组相同时间点比较及组内不同时间点比较Evan's比率差异均无统计学意义(Pgt;0.05,表3,图1)。

GroupTarlovscore1d7d14d60dEvan＇sratio1d7d14d60d Experimental(n=15)2．22±0．453．24±0．113．56±0．443．43±0．310．24±0．040．33±0．060．39±0．080．42±0．05 Control(n=10)2．56±0．683．41±0．453．67±0．253．55±0．280．25±0．060．32±0．050．38±0．070．43±0．04

图1 各组术前术后犬头颅CT对比表现
Fig 1 Comparison of pre-operative and post-operative CT scan between two groups
A:The pre-operative CT of No. 2 dog in experimental group; B:The post-operative CT of No. 2 dog in experimental group; C:The pre-operative CT of No. 3 dog in experimental group; D:The post-operative 14 d CT of No. 3 dog in experimental group; E:The pre-operative CT of No. 5 dog in experimental group; F:The post-operative 14 d CT of No. 5 dog in experimental group; G:The pre-operative CT of No. 8 dog in experimental group; H:The post-operative 60 d CT of No. 8 dog in experimental group; I:The pre-operative CT of No. 4 dog in control group; J:The post-operative 60 d CT of No. 8 dog in control group; K:The pre-operative CT of No. 13 dog in control group; L:The post-operative 60 d CT of No. 8 dog in control group.

讨 论

脑积水的病理改变是脑室系统扩大，脑凸面或脑底的蛛网膜粘连或闭塞，其发病机制一般认为外伤性脑积水是由于外伤血凝阻塞中脑导水管，红细胞或纤维蛋白阻塞蛛网膜下腔， 使脑脊液吸收障碍[3]。后期蛛网膜纤维化，使蛛网膜颗粒吸收障碍。由于脑底和大脑表面蛛网膜颗粒部位形成纤维粘连及机化，脑沟脑池蛛网膜颗粒阻塞，阻碍脑脊液循环，脑室系统的压力暂时性升高，则脑室逐渐扩大[4,5]。

建立有效的脑积水动物模型是对脑积水进行研究的前提，标准的、高度可重复的实验动物模型，对研究脑积水病理生理特征、诊断及治疗有重要作用。目前，脑积水动物模型的制作机制主要分4类；闭塞脑脊液通路、通过引入致畸物诱导、病毒或细菌感染、遗传学及基因干扰手段，1914年，Dandy和Blackfan在犬的导水管远端置入棉拭子从而引起近端脑室扩大，形成了犬梗阻性脑积水模型。1932年，Dixon等描述了向大鼠枕大池注入白陶土诱导交通性脑积水模型[6]。从此枕大池注入白陶土混悬液法成为目前应用最广泛的制作交通性脑积水模型的方法，这种方法形成脑积水的机制主要是进入蛛网膜下腔的大量白陶土颗粒沉积在脑干周围及颅底的蛛网膜下腔，引起反应性炎症，导致脑干周围蛛网膜下腔粘连、梗阻，形成脑积水。但研究表明，由于白陶土细微的颗粒在蛛网膜下腔弥散的特性，发现在蛛网膜下腔内可以形成大量“上皮样结节”，白陶土所致的炎性反应可导致脑组织肿胀和组织损害，引起脑脊液的生理学改变和组织学干扰[7]。

Del Bigio等[8]通过注射硅油，成功诱导了家兔脑积水模型。他将脑积水形成以后的模型动物尸解发现，高黏滞度的硅油聚集在注射部位，并未沿着蛛网膜下腔进行播散，也未进入脑室系统， 该方法诱导的脑积水不会在室管膜表面、蛛网膜或者软脑膜引起任何炎性反应。硅油是一种具有耐热性、抗氧化性、耐低温、耐放射性等特性的惰性液态高分子化合物[9,10]，其无毒稳定的特点已得到长期验证。硅油具有憎水性，在水中仍保持聚集，不会溶解。国内李松等[11]利用硅油成功制作了脑积水模型，证明这种方法更适合于临床脑积水诊断和治疗技术研究。

本组实验使用的Fluid200型硅油具有较高的黏滞度，在注射入犬枕大池四脑室内后，硬脊膜出口用明胶海绵填塞，由于硅油流动性差，可自动塑形并黏附于四脑室壁，即使在每日分泌脑脊液的冲刷作用下仍可保持在原位，不会在蛛网膜下腔内扩散，更不会对远离注射位置的蛛网膜绒毛有直接影响。

从我们的实验中发现，两组死亡率无明显差异、造模成功的犬行为学表现无明显差异、模型的脑室大小无明显差异，表明两种方法均可制作脑积水模型，但从造模成功率对比发现，用硅油组比用白陶土组造模成功率高。实验中还发现，经皮切开暴露寰枕筋膜直视下注入药物(白陶土/硅油)较经皮盲穿注入药物可降低死亡率。虽然两组均有死亡，但多数为可控性因素，如年龄偏大、体质较弱、术后感染、术中操作等。在造模术后急性期犬表现出反应迟钝，对外界刺激表现淡漠、少食或拒食拒饮、嗜睡等症状，可能为急性脑积水时颅压骤然升高导致的急性反应。由于硅油及白陶土造成的梗阻为不完全性，在度过最初几天的迅速进展期后，上述症状于术后7～9 d均有不同程度缓解。进食后6只实验犬发生呕吐，可能是脑积水的症状，也可能是药物刺激四脑室所致，不过症状大部分于1 w内缓解。部分实验犬在急性期后出现行走不稳，可能由于脑积水所致病理损害。对照组犬行为与手术前比较无明显异常。实验发现，实验组犬脑室随时间推移出现进行性扩大的趋势，大脑皮质萎缩变薄。因此该方法造成的脑积水模型是一种进展而成的慢性模型，与临床常见的蛛网膜下腔出血导致的脑积水和肿瘤梗阻引起的脑积水有相似之处。

本组在制作过程中有以下体会：①宜选择成年健康大犬，不选择反应较迟钝、饮食较少的犬；②犬枕骨大孔与寰椎间间隙非常小，必须要咬除寰椎后弓及枕骨大孔才可暴露寰枕筋膜，但此处寰枕筋膜与枕骨粘连非常紧密，在咬开枕骨时极易撕裂硬脊膜，从而导致术后无法严密缝合。所以在咬开枕骨大孔时一定要轻柔；③用硅胶管塞入第四脑室时应先释放至少等量脑脊液后再注药，由于第四脑室非常小，所以应选用极细小的硅胶管顿头端插入四脑室，否则易导致出血或脑干损伤；④注射的白陶土因为是混悬液，流动性大，沉淀物易流出四脑室而沉淀在脑室外，且造成的梗阻为不完全性，随着脑脊液的冲洗易导致造模失败，从本组实验就可见，用白陶土制造的脑积水犬模型，有50%造模失败，均源于此。而硅油有粘附性且较粘稠，流动性小，用明胶海绵堵塞出口即可将硅油顺利注入第四脑室，所以造模成功率较高；⑤术后常规使用广谱抗生素1 w；⑥暴露寰枕筋膜时，严格沿中线分离肌肉，这样出血少对肌肉损伤小。

目前，虽然已建立了各类脑积水的动物模型，但各种模型与人类脑积水的相符程度究竟如何尚需进一步探讨，未来脑积水动物模型研究需要通过建立一种或尽可能少的几种模型将目前在脑积水各种形成机制上的成果相结合统一，才能结束目前脑积水的复杂分类及治疗困境。

1Goldsmith HS,Steward E,Duckett S. Early application of pedicled omentum to the acutely traumatised spinal cord [J]. Paraplegia,1985,23(2):100-112.

2O'Hayon BB,Drake JM,Ossip MG,et al. Frontal and occipital horn ratio:A linear estimate of ventricular size for multiple imaging modalities in pediatric hydrocephalus [J]. Pediatr Neurosurg,1998,29(5):245-249.

3唐太昆,宋黎,毛希宏,等. 神经内镜下第三脑室底造瘘术治疗非交通性脑积水41例临床观察 [J]. 中国神经肿瘤杂志,2007,5(3):172-175.

4王俊伟,孟辉,吴南,等. 49例脑积水脑室-腹腔分流术失败原因分析及改进 [J]. 中华神经外科杂志,2011,27(1):87-89.

5孟辉,唐荣锐,王俊伟,等. 梗阻性脑积水经第三脑室底造瘘术后颅内压变化规律 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志,2014,13(5):426-429.

6陈东汉,王占祥. 脑积水动物模型研究进展 [J]. 中华实验外科杂志,2010,27(10):1557-1558.

7Kondziella D,Ludemann W,Brinker T,et al. Alterations in brain metabolism,CNS morphology and CSF dynamics in adult rats with kaolin-induced hydrocephalus [J]. Brain Res,2002,927(1):35-41.

8Del Bigio MR,Bruni JE,Vriend JP. Monoamine neurotransmitters and their metabolites in the mature rabbit brain following induction of hydrocephalus [J]. Neurochem Res,1998,23(11):1379-1386.

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10Xu XJ,QL Ye,GX Ye. Temperature dependence of coercivity behavior in iron films on silicone oil surfaces [J]. Phys Lett,2006,361(10):429-433.

11李松,张恒,毛伯镛.犬脑积水动物模型的建立及评估 [J].中国修复重建外科杂志,2007,21(6):617-620.

Establishmentandevaluationofhydrocephalusmodelindogs

ZHAODongsheng1,JIANGXiaofan1,JIXituan1,FEIZhou1,HEXiaosheng1,SUNGangfeng1,DUANFei2,WANGZhengjun1

1DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,Xi'an710032;2DepartmentofNeurosurgery,FirstPeople'sHospitalofXianyangCity,Xianyang712000,China

ObjectiveTwo hydrocephalus models in dogs were established and evaluated.MethodsForty healthy adult mongrel dogs were randomly divided into control and experimental group with 20 in each. Experimental dogs were injected silicone oil into the fourth ventricle through a silicone tube,while the dogs in control group were injected kaolin suspension. All the dogs were given CT and neurological examination to exclude congenital ventricular enlargement and neurological abnormity before and after hydrocephalus induction.ResultsThe experimental group got hydrocephalus model in 15 cases (75%) successfully,and the control group got hydrocephalus model in 8 cases (40%). There were significant difference in success rate between two groups (Plt;0.05).ConclusionThe dog model of hydrocephalus induced by the injecting of silicone oil into the fourth ventricle has a higher success rate which is suitable for the studies.

Dog; Hydrocephalus model; Kaolin; Silicone oil

1671-2897(2016)15-346-04

R 742.7

A

陕西省科技基金资助项目(SQ2013SF12E01437)

赵东升，主治医师，博士研究生，E-mail:zds0002@163.com

*通讯作者：费舟，教授、主任医师，博士生导师，E-mail:feizhou@fmmu.edu.cn

2014-07-04；

2014-12-20)