慢性硬膜下血肿外膜中转化生长因子-β1的表达及临床意义

马京库 左毅 李宝明 陈尚军 王辉 惠军 谢国强 张彬 吴东飞 董克辛 于清宇

(1陕西省核工业215医院神经外二科，陕西 咸阳 712000; 2大连市友谊医院神经外科，辽宁 大连 116000; 3绥化市第一医院神经外科，黑龙江 绥化 152000)

·论著·

慢性硬膜下血肿外膜中转化生长因子-β1的表达及临床意义

马京库1,2左毅1李宝明1陈尚军1王辉1惠军1谢国强1张彬1吴东飞1董克辛2*于清宇3

(1陕西省核工业215医院神经外二科，陕西 咸阳 712000;2大连市友谊医院神经外科，辽宁 大连 116000;3绥化市第一医院神经外科，黑龙江 绥化 152000)

目的检测慢性硬膜下血肿(CSDH)外膜中转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达情况。方法应用免疫组化检测32名慢性硬膜下血肿患者血肿外膜中TGF-β1的表达情况。在5个高倍视野下每张切片中的成纤维细胞、血管内皮细胞、炎细胞数大于500个为富于细胞组，共16例，在100～500之间为较丰富细胞组，共12例，小于100个为缺乏细胞组，共4例。结果TGF-β1在富于细胞组表达呈强阳性，在较丰富细胞组表达呈阳性。结论TGF-β1促进血肿外膜新生血管生成，促进血肿外膜纤维化。

慢性硬膜下血肿; 转化生长因子-β1; 血肿外膜; 新生血管生成; 纤维化

目前多数学者认为慢性硬膜下血肿(chronic subdural hematoma,CSDH)发病机制与血肿外膜新生血管生成及其通透性增加有关[1]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种多功能细胞因子，能促进新生血管生成，促进组织纤维化[2]。本实验通过检测CSDH患者血肿外膜中TGF-β1的表达情况，进一步证明CSDH发病机制与血肿外膜新生血管生成及其通透性增加有关。

对象与方法

一、一般资料

2010年1月至2012年12月我科收治32名CSDH患者，其中男性患者20例，女性患者12例。年龄在45～89岁之间，平均年龄(65.3±11.2)岁。有6例患者无明显的头部外伤史，均为老年患者；26例患者发病前均有不同程度的头部外伤史，外伤时间1～5个月。32名患者中病程最短24 d，最长1年，平均(40±3)d。GCS 9～12分3例，13～15分29例。

二、临床表现

头痛、头晕27例，恶心、呕吐4例，肢体乏力14例，一侧巴宾斯基征阳性6例，智力减退及精神障碍2例，癫痫2例，感觉障碍3例，失语1例，小便失禁1例。

三、影像学表现

全部患者均行头颅计算机断层摄影(computed tomography,CT)检查，CT示等密度14例，混合密度8例，低密度10例，单侧血肿29例，双侧血肿3例。6例患者经头部磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查确诊，MRI检查示长T1、长T2。5例患者在全麻下行钻孔引流术，均为老年患者；27例患者在局麻下行钻孔引流术。3例双侧CSDH患者中有1名患者分期行双侧钻孔引流术，其余2名患者在血肿量多的一侧行钻孔引流术，术后另一侧血肿经保守治疗后均逐渐吸收。

四、取材方法

术中在血肿最厚的部位钻孔，用尖刀“十”字切开硬脑膜，小心保护硬膜下血肿外膜的完整，沿钻孔边缘环形切开血肿外膜，取材大小约0.5 cm×0.5 cm的血肿外膜留作病理。

五、主要试剂与方法

免疫组化技术采用(streptavidin-perosidase,SP)法。兔抗人多克隆抗体TGF-β1(即用型)，SP试剂盒和二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)酶底物显色试剂盒均购自福州迈新公司。

六、分组方法

5个高倍视野下计数每张切片中的成纤维细胞、血管内皮细胞、炎细胞数。细胞数≥500个，为富于细胞组，共16例。细胞数在100～500个，为较丰富细胞组，共12例。细胞数≤100个，为缺乏细胞组，共4例。

七、结果判断标准

在实验中发现阳性染色的标本阳性细胞着色强度差异不大，因此免疫组织化学染色结果评价主要根据阳性细胞占所有靶细胞的比例。以细胞质着棕黄色为阳性表达细胞。5个高倍视野观察每张切片，TGF-β1阳性率≤10%为阴性(-)，10%～25%为弱阳性(+)，25%～50%为阳性(++)，gt;50%为强阳性(+++)。

八、统计学分析

所有数据均在计算机软件SPSS 16.0上进行统计学的分析处理。

结 果

一、CSDH外膜组织中TGF-β1的表达情况

CSDH外膜组织经TGF-β1免疫组化染色后，高倍显微镜下观察发现细胞质着棕黄色，TGF-β1表达呈阳性，主要表达在成纤维细胞、血管内皮细胞和炎细胞的胞浆中(表1,2)。

表1 CSDH外膜组织中TGF-β1表达的阳性率(例数，%)
Tab 1 Positive expression rate of TGF-beta 1 in the outer membrane of CSDH (n,%)

GroupnTGF⁃β1(+)Positiverate(%) Cellabundancegroup1616a84．77% Cellrichgroup121236．50% Celldeficiencygroup400

aPlt;0.05,vsthe cell deficiency group.

表2 CSDH外膜组织中TGF-β1表达的阳性强度(例数)
Tab 2 Positive expression intensity of TGF-beta 1 in the outer membrane of CSDH (n)

GroupnTGF⁃β1(+)Theintensityofpositive Cellabundancegroup1616a+++ Cellrichgroup1212++ Celldeficiencygroup40⁃

aPlt;0.05,vscell deficiency group.

Note:+ represents positive; -represents negative.

二、苏木精-伊红HE (hematoxylin-eosin staining )染色增生的纤维和血管

CSDH外膜类似炎性肉芽组织，有大量的新生毛细血管，可见成纤维细胞、纤维细胞、平滑肌细胞、炎细胞、巨噬细胞和胶原纤维(图1～3)。

图1 HE染色增生的纤维细血管(HE,×40)
Fig 1 Fiber thin blood vessels by HE staining (HE,×40)

图2 HE染色增生的纤维细血管(HE,×100)
Fig 2 Fiber thin blood vessels by HE staining (HE,×100)

图3 HE染色增生的纤维细血管(HE,×400)
Fig 3 Fiber thin blood vessels by HE staining (HE,×400)

图4 富于细胞组TGF-β1表达呈(+++)
Fig 4 Positive expression of TGF-beta 1 in cell abundance group

图5 较丰富细胞组TGF-β1表达呈(++)
Fig 5 Positive expression of TGF-β1 in cell rich group

图6 缺乏细胞组TGF-β1表达呈(-)
Fig 6 Negative expression of TGF-β1 in cell deficiency group

三、免疫组织化学染色

在富于细胞组及较丰富细胞组，CSDH外膜中可见到成纤维细胞、血管内皮细胞和炎细胞的胞浆着棕黄色。TGF-β1在富于细胞组的阳性率为84.77%，表达呈强阳性(+++)。TGF-β1在较丰富细胞组中阳性率为36.50%，表达强度呈阳性(++)。而在缺乏细胞组中，未见到着黄色的细胞，TGF-β1表达呈阴性(-)(图4～6)。

讨 论

CSDH是一种神经外科常见的疾病，约占颅内血肿的10%[3]。目前关于CSDH的发病机制研究较多，其中“血肿外膜新生血管生成、出血”机制是研究的热点[4]。电镜下观察慢性硬膜下血肿外膜可见到大量的新生毛细血管，血管内皮细胞间隙增宽，内皮细胞之间的间隙有红细胞及血浆成分渗出。血肿外膜新生血管基底膜部分缺如，血管壁通透性较高，易引起血肿外膜反复出血，导致CSDH不断扩大[5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种促进血管生成的细胞因子，可以促进血管内皮细胞有丝分裂和迁移，促进血管内皮细胞增殖，增加血管的通透性[6]。CSDH患者的血肿外膜中VEGF表达呈强阳性[7]。Shono等[8]检测CSDH患者的血肿液与外周静脉血中的VEGF浓度时，发现血肿液中VEGF浓度是外周血中的28倍。血肿外膜新生血管生成及其通透性增加促进CSDH不断扩大[9]。

TGF-β1是一种多肽细胞因子，由T淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞及纤维母细胞分泌，在人血小板及骨中含量最高，能促进新生血管生成及新生血管的成熟进程，并与人体多种器官及组织的纤维化疾病密切相关[10～12]。TGF-β1调节血管内皮细胞的趋化性迁移、增生和分化。在组织损伤早期，TGF-β1刺激巨噬细胞分泌血管发生因子，使内皮细胞分裂增生、趋化，向无血管或血管少的区域迁移，逐渐形成毛细血管芽，形成新生的毛细血管[13]。TGF-β1促进血管外膜成纤维细胞(adventitia fibroblasts,AF)的增殖、迁移，参与AF相关的血管重塑[14]。TGF-β1刺激血管内皮细胞大量分泌VEGF，VEGF促进新生血管生成[15]。

本实验观察发现CSDH外膜类似炎性肉芽组织，有大量的新生血管，有成纤维细胞、纤维细胞、平滑肌细胞、炎细胞、巨噬细胞和胶原纤维。血管内皮细胞肥大。三组病例中，富于细胞组16例，病程平均为45 d，平均年龄70岁，病情重，TGF-β1阳性率为84.77%，表达呈强阳性(+++)。较丰富细胞组12例，病程平均为30 d，平均年龄65岁，病情较重，TGF-β1阳性率为36.50%，表达呈阳性(++)。缺乏细胞组4例，TGF-β1阳性率为0，病程平均为26 d，平均年龄为60岁，病情轻，表达呈阴性(-)。标本细胞数的多少与其病程，年龄，病情轻重呈正相关。富于细胞组及较丰富的细胞组TGF-β1表达呈阳性，主要表达在成纤维细胞，血管内皮细胞和炎细胞的胞浆。缺乏细胞组TGF-β1表达呈阴性，出现阴性结果的标本细胞数少，胶原纤维多，玻璃样变性显著。实验中细胞贫富差异可能与取材的部位、大小、细胞形态学改变和组织变性有关，在电刀切片的过程中部分细胞组织结构被破坏及发生热变性。不除外与CSDH患者的病程、年龄及病情轻重等有关，由于本实验病例数较少，其临床意义有待进一步研究。

综上所述，TGF-β1是一种促进新生血管生成多肽类细胞因子[16]，CSDH的发病机制与血肿外膜新生血管生成有关[4]，本实验证明了TGF-β1在CSDH外膜中表达呈阳性，因此TGF-β1与CSDH形成机制有关。

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Expressionoftransforminggrowthfactor-beta1inoutermembraneofchronicsubduralhematomaanditsclinicalsignificance

MAJingku1,2,ZUOYi1,LIBaoming1,CHENShangjun1,WANGHui1,HUIJun1,XIEGuoqiang1,ZHANGBin1,WUDongfei1,DONGKexin2,YUQingyu3

1DepartmentofNeurosurgery,The215HospitalofShanxiProvinceNuclearIndustry,Xianyang712000;2DepartmentofNeurosurgery,DalianFriendshipHospital,Dalian116000;3DepartmentofNeurosurgery,FirstHospitalofSuihua,Suihua152000,China

ObjectiveThe expression of transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta 1) in the outer membrane of chronic subdural hematoma (CSDH) was detected.MethodsThe expression of TGF-beta 1 was detected in the outer membrane of 32 patients with chronic subdural hematoma by using immunohistochemical technique. At high magnification ×5,the number of fibroblasts,endothelial cells,and inflammatory cells in each section more than 500 was divided into cell abundance group (16 cases),the number between 100 and 500 was the cell rich group (12 cases),and the number less than 100 was cell deficiency group (4 cases).ResultsTGF-beta 1 was strong positively expressed in cell abundance group,and was positively expressed in the cell rich group.ConclusionTGF-beta 1 promotes the angiogenesis in outer membrane of hematoma and the fibrosis of outer membrane of hematoma.

Chronic subdural hematoma; Transforming growth factor-beta1; The hematoma outer membrane; New blood vessels to generate; Fibrosis

1671-2897(2016)15-342-04

R 739.4

A

马京库，医师，硕士研究生，E-mail:majingku2013@163.com

*通讯作者：董克辛，主任医师，硕士生导师，E-mail:xin_ke_dong@163.com

2015-03-30；

2015-11-20)