犬脑枪弹伤后脑组织NGF和细胞凋亡的表达

侯明山 杨军 蔺鹏桢 刘晓斌 曹杰 (陕西省人民医院神经外科，西安医学院附属医院, 陕西 西安 710068)

犬脑枪弹伤后脑组织NGF和细胞凋亡的表达

侯明山*杨军 蔺鹏桢 刘晓斌 曹杰
(陕西省人民医院神经外科，西安医学院附属医院, 陕西 西安 710068)

目的研究犬枪弹伤后脑组织中神经生长因子(NGF)和神经细胞凋亡的变化规律。方法24只杂种犬，随机分为对照组，枪弹伤组。采用德国小口径步枪子弹致犬颅脑额叶切线伤(TBI)。用免疫组织化学方法以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法检测对照组及枪弹伤后2 h、6 h、12 h、24 h和48 h各不同时期弹道挫伤区、震荡区、海马及脑干神经元中NGF和神经细胞凋亡的表达。结果对照组脑神经元中NGF和神经细胞凋亡表达弱，枪弹伤组挫伤区、震荡区、海马及脑干神经元中，NGF的表达2 h开始增加(P<0.05)，12 h达高峰(P<0.01)，24 h开始下降。神经细胞凋亡表达2 h开始增加(P<0.05)，24 h达高峰(P<0.01)，48 h开始下降。且NGF蛋白表达距离伤道越近表达越明显，神经细胞凋亡在挫伤区、脑干较震荡区、海马区弱(P<0.01)。它们在不同区域、不同时间之间的表达不完全一致。结论NGF和神经细胞凋亡在弹道挫伤区、震荡区、海马及脑干神经元表达增强，但在脑组织中表达的分布范围和时空变化规律不一致，NGF在抗细胞凋亡中具有重要作用。

脑; 枪弹伤; 神经生长因子; 神经元; 凋亡; 免疫组织化学

火器性颅脑损伤是一种严重的创伤，具有死亡率、致残率高，救治难度大等特点，是战、创伤研究的重点之一。我们采用低速弹德国小口径步枪制作犬颅脑切线伤(tangent brain injury, TBI)模型[1]，从分子生物学角度对犬火器性颅脑损伤后神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和神经细胞凋亡的变化规律进行研究，探讨其在颅脑火器伤生命活动中的变化规律，为临床救治颅脑火器伤提供理论依据。

材料与方法

一、动物

西安地区杂种犬24只(第四军医大学西京医院动物实验室提供)，雌雄不限，体质量(18.8±2.6)kg，随机分为正常对照组(n=4)和枪弹伤组(n=20)。

二、试剂

小鼠抗人、大鼠和小鼠NGF单克隆抗体为第一抗体，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒；原位细胞凋亡检测试剂盒(均为湖北武汉博士德生物工程有限公司)等。

三、动物模型的建立

用30 g/L戊巴比妥钠(0.03 g/kg)静脉麻醉，气管插管后，固定于射击靶台上，前额眶上约2 cm固定于靶孔处，于睫毛反射恢复后，距25 m用德国小口径步枪弹(子弹弹径5.56 mm，质量2.57 g，撞击速度350 m/s、致伤能量160.0 J)致脑切线伤(TBI)。

四、样本制作

枪弹上组枪击后除5只动物未出现呼吸停止外，其余动物出现呼吸骤停，随后恢复自主呼吸。心率减慢，部分动物出现心律不齐。持续静脉麻醉下，在5个时间点(2 h、6 h、12 h、24 h和48 h，各4只)开胸，主动脉插管,剪开右心房，灌注生理盐水流淡红色血液时，换4%多聚甲醛磷酸盐酸缓冲液(phosphate buffered saline, PBS、pH7.4)灌注至右心房流出清亮液为止，开颅取全脑，中性多聚甲醛液固定24 h，取弹道挫伤区(弹道旁0.5 cm)、震荡区(弹道旁3.0 cm)、海马、脑干及对照组(除不施行枪弹射击外，其它操作同射击损伤组)额叶、海马、脑干区组织(与损伤组同侧)。常规石腊包埋，切片厚5 μm，备免疫组化用。

五、免疫组织化学测定

随机抽取不同时间点、不同分布区域每个动物标本2张并随机分为两组，一组采用SABC，小鼠抗人，大鼠和小鼠NGF蛋白为第一抗体。另一组用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferease-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick and labeling, TUNEL)染色参照试剂盒说明书进行染色，用已知阳性细胞为阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗。应用Quantiment 570C图像分析系统对NGF、凋亡阳性细胞测定，在放大400倍条件下对各组每张免疫组化染色切片随机测定10处单位面积(计算机系统提供窗口面积)内阳性细胞数，取平均数。

六、统计学处理

GroupContusionConcussionHippocampusBrainstem Control3．28±1．053．76±1．035．60±1．223．19±1．05 Post⁃injury 2h33．23±1．80ad28．27±1．95ad30．13±1．93ad22．61±2．02a Post⁃injury 6h38．72±1．96abd35．07±2．02abd36．53±2．08abd23．32±1．98a Post⁃injury 12h51．66±1．99abcd42．65±1．85abcd44．80±1．92abcd32．18±1．79abc Post⁃injury 24h42．46±1．87abcd40．29±1．83abcd41．36±2．02abcd28．35±1．95abc Post⁃injury 48h36．64±1．68ad39．27±1．71abd39．16±2．31abd25．33±1．91a

aP<0.01,vscontrol group;bP<0.05,cP<0.01,vspost-injury 2 h;dP<0.01,vsbrain stem.

结 果

对照组神经元中NGF、凋亡细胞呈弱表达。枪弹伤组弹道挫伤区、震荡区、海马及脑干区神经元中，伤后总的趋势：NGF蛋白2 h明显增加(P<0.01)，12 h达高峰(P<0.01)，24 h开始下降，但仍高于2 h组(P<0.05)。相同时间点挫伤区、震荡区、海马区之间表达无差异，但与脑干组的表达差异存在着显著性意义(P<0.01)。凋亡神经细胞2 h开始增加(P<0.05)，24 h达高峰(P<0.01)，48 h开始下降，相同时间点震荡区、海马区与挫伤区及脑干的表达有显著差异(P<0.05, 表1,2)。

GroupContusionConcussionHippocampusBrainstem Control2．67±1．543．67±1．343．24±1．842．20±1．65 Post⁃injury2h11．90±2．42a16．60±2．56a18．10±1．96a10．20±1．85a Post⁃injury6h16．46±1．90bc27．70±1．72bcde26．16±1．97bcde15．60±1．92bcd Post⁃injury12h18．50±2．60bc30．17±2．95bce32．90±2．13bcde20．16±3．04bcd Post⁃injury24h23．05±1．89bcd38．26±2．78bcde35．61±2．48bcde22．23±1．76bcd Post⁃injury48h20．17±1．87bc31．41±2．56bce34．19±2．68bcde21．12±1．99bcd

aP<0.05,vscontrol group;bP<0.01,vscontrol group;cP<0.01,vspost-injury 2 h;dP<0.05,vspost-injury 6 h;eP<0.01,vsbrain stem and contusion.

讨 论

细胞坏死和细胞凋亡是细胞死亡的两种形式，细胞凋亡是由于细胞内外因素激活细胞本身自杀程序而引起的一种死亡形式，又称程序性死亡，在病理和生化方面与细胞死亡明显不同。细胞凋亡的形态学改变是细胞的核固缩、崩解、染色质固缩并凝集结成块聚集于核膜，形成凋亡小体，但细胞膜一直完整，细胞内容物不溢出到细胞间隙中，而细胞坏死主要是细胞体肿胀，线粒体及其他细胞器膨大，最终包膜破裂，胞内容物质溢入到细胞间隙，凋亡的发生机制极为复杂，至今尚未完全阐明，研究表明生物体内外多种因素可以诱发和调控细胞凋亡，现已发现调控凋亡过程的基因有两类：即促凋亡基因和抗凋亡基因[2]。研究发现颅脑损伤后神经细胞的凋亡与原癌基因bcl-2、bax、抑癌基因p53、早期快反应蛋白c-myc、热休克蛋白等多种因素有密切关系[3～5]，表明颅脑损伤后神经细胞的死亡和凋亡调控机制非常复杂。NGF是最典型的一种神经营养因子，它是一种蛋白类多肽，在生物体内广泛分布，广泛作用于神经系统和非神经系统，具有神经元营养和促进神经元突起生长双重生物学功能，在神经细胞的存活、增殖、分化以及在神经元受损的保护中起重要作用[6,7]。研究表明，脑损伤后神经生长因子参与机体对脑损伤的自身保护机制, 增强机体的耐缺氧能力，促进神经元的再生和功能恢复，起到对神经元的保护作用，参与神经细胞生长、分化和抗损伤修复的调节，与机体组织细胞增殖和凋亡间周转状态直接相关[8]。

我们采用低速弹德国小口径步枪致犬TBI模型，利用免疫组织化学对弹道挫伤区、震荡区、海马及脑干区NGF、凋亡细胞阳性神经元检测发现：火器性损伤NGF、凋亡细胞的变化规律与其它脑损伤及脑缺血模型对NGF、凋亡细胞阳性神经元研究报到在表达出现时间上有所不同[9,10]，枪弹上后凋亡细胞的表达与创伤性颅内损伤的研究在时空变化上具有一致性，但分布区域存在一定差异，说明损伤对两者表达的调节不同。颅脑火器伤不仅受机械性损伤和缺血性损伤，而且弹丸冲击波对周围脑组织产生很大影响，具有其自身的特殊性，冲击波在脑内产生巨大超压，形成正、负压交替的传导性损伤，这种损伤可导致动物血压下降、呼吸暂停，进一步加重脑损害，其损伤机制不同于非火器性损伤。我们研究发现距伤道越近，表达越明显，但海马区的表达具有其特殊性，并且不同时间之间的表达存在着一定的差异。NGF在挫伤区、震荡区、海马区与脑干组差异较大(P<0.05)，与我们研究犬颅脑枪弹伤后热休克蛋白70和脑源性生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在脑组织中的分布非常相似[11,12]，说明二者在火器性颅脑损伤后的表达存在密切联系，共同参与神经元的保护。我们在研究中发现神经元坏死越明显的区域，神经细胞凋亡表达越弱，挫伤区的表达较震荡区、海马区及脑干弱(P<0.01)，可能是枪弹上后挫伤区严重创伤后神经细胞溶解坏死、能量代谢衰竭、蛋白质合成障碍等影响细胞凋亡的表达。实验提示犬颅脑枪弹上后NGF的表达快于细胞凋亡，与细胞凋亡有密切关系，参与神经细胞的生长分化和损伤修复的调节，对神经细胞的创伤耐受、增殖分化、生长发育和损伤修复等发挥重要作用。

1封亚平, 章翔, 费舟, 等. 犬脑枪弹伤模型建立及相关生理、病理指标观察 [J]. 第四军医大学学报, 2002, 23(23): 2145-2148.

2李继硕, 主编. 神经科学基础 [M]. 北京: 高等教育出版社, 2002: 37-39.

3于如同, 于涛, 官鹏, 等. 脑外伤后氧化应激对神经细胞凋亡及c-myc蛋白表达的影响 [J]. 中华创伤杂志, 2002, 18(12): 719-721.

4侯明山, 章翔, 费舟, 等. 犬颅脑枪弹伤后神经细胞凋亡及bcl-2的表达 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2004, 3(3): 242-244.

5杨新宇, 杨树源, 张建宁, 等. 大鼠神经细胞内bcl-2和bcl-xl水平的变化及意义 [J]. 中华外科杂志, 2002, 40(9): 702-704.

6Bueker ED, Schenkein I, Bane JL. The problem of distribution of nerve growth factor specific for spinal and sympathetic ganglia [J]. Cancer Res, 1960, 20(5): 1220-1228.

7Cohen S. Purification 0f a nerve-growth promoting protein from the mouse salivary gland and its neuro-cytotoxic antiserum [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1960, 46(3): 302-311.

8Zhou Z, Chen H, Zhang K, et a1. Protective effect of nerve growth factor on neurons after traumatic brain injury [J]. J Basic Clin Physiol Pharmacol, 2003, 14(3): 217-224.

9郭新荣, 王瑞辉, 李娜, 等. 颅脑损伤动物模型制备及脑组织中神经生长因子、脑源性神经营养因子变化的实验研究 [J]. 创伤外科杂志, 2015, 17(3): 256-259.

10张雁儒, 张风兰, 甘子明, 等. 闭合性脑损伤后NGF基因表达时间性变化的实验研究 [J]. 新疆医科大学学报, 2004, 27(3): 226-228.

11侯明山, 章翔, 费舟, 等. 犬颅脑枪弹伤后脑组织中热休克蛋白70和c-myc的表达 [J]. 第四军医大学学报, 2004, 25(4): 310-313.

12杨江河, 章翔, 宋少军, 等. 犬颅脑枪弹伤后脑组织中BDNF蛋白的表达及意义 [J]. 第四军医大学学报, 2003, 24(22): 2063-2065.

ExpressionofNGFandapoptosisincaninebrainswithcraniocerebralgunshotwounds

HOUMingshan,YANGJun,LINPengzhen,LIUXiaobin,CAOJie

DepartmentofNeurosurgery,ShaanxiProvincialPeople'sHospital,TheAffiliatedHospitalofXi'anMedicalUniversity,Xi'an710068, China

ObjectiveThe expressions and changes of nerve growth factor (NGF) and neuronal apoptosis in brain following craniocerebral gunshot wounds in dogs are investigated.MethodsTwenty-four dogs were randomly divided into control and injury group. The canine models of tangent brain injury (TBI) were established by German-made bullets of small caliber rifles. Specimens were taken from canine brain in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem at 2, 6, 12, 24 and 48 h after trauma, respertiely. NGF positive neurons were observed by immunohistochemical method, and neuron apoptosis cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferease-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick and labeling (TUNEL).ResultsLower expressions of NGF and neuronal apoptosis were detected in the control group. Positive expressions of NGF and neuronal apoptosis in neurons in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem were increased at 2 h (P<0.05) after craniocerebral gunshot wounds. Positive expression of NGF peaked at 12 h (P<0.01) and then decreased at 24 h. Apoptotic cells in neurons reached the peak at 24 h (P<0.01) and began to decrease at 48 h. The more near the trajectory, the more obvious was the positive expression of NGF. The expression of neuronal apoptosis in contusion area and brain stem was lower than those in concussion and hippocampus (P<0.05). The expressions differed with areas and time points.ConclusionThe expressions of NGF and neuronal apoptosis in the trajectory contusion area, the trajectory concussion area, hippocampus and brain stem are the early reaction to craniocerebral gunshot wounds. The expression regulation of NGF is not similar to that of neuronal apoptosis at different time points and areas. NGF plays an important role in cell apoptosis.

Gunshot wounds; Nerve growth factor; Neurons; Apoptosis; Immunohistochemistry

1671-2897(2016)15-205-04

·神经损伤研究·

R 651.15

A

侯明山，副主任医师，E-mail：houms68@163.com

*通讯作者： 侯明山，副主任医师，E-mail：houms68@163.com

2015-12-03；

2016-01-20)