14 MeV快中子辐照对大鼠免疫系统的损伤

王潇，于颖琪，郑洁莹，单振刚，雷润宏，隋丽，孔福全，陈洪涛，邓玉林，马宏

(1.北京理工大学 生命学院，北京 100081；2.中国原子能科学研究院 核物理所，北京 102413)



14 MeV快中子辐照对大鼠免疫系统的损伤

王潇1,2，于颖琪2，郑洁莹2，单振刚1，雷润宏1，隋丽2，孔福全2，陈洪涛2，邓玉林1，马宏1

(1.北京理工大学 生命学院，北京 100081；2.中国原子能科学研究院 核物理所，北京 102413)

用14 MeV快中子对Wistar雄性大鼠进行5 Gy的全身照射，观察其免疫系统损伤情况及氧化应激的相关变化. 大鼠分为辐射组和对照组，分别在辐射后1,7,14 d 3个时间点取血液、胸腺和脾脏进行研究. 结果表明，辐照后第1 d，辐照组大鼠白细胞和淋巴细胞数量降至最低，照后第7、14 d有所恢复，但仍不足正常组的1/2. 血小板数在照后第1 d开始减少，至第7 d达到最低值，第14 d仍与正常组有显著差异. 而大鼠骨髓有核细胞总数辐照后14 d明显低于正常组. 另外胸腺和脾脏均出现萎缩，脏器指数明显减小. 血浆、胸腺和脾脏的总抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量均有不同程度的升高趋势. 说明快中子辐射影响血浆、胸腺和脾脏的抗氧化应激能力，诱导细胞凋亡或坏死，造成胸腺和脾脏的萎缩以及一系列组织形态的改变，从而严重影响大鼠的正常免疫功能.

快中子；大鼠；辐射损伤；免疫系统

随着人类科学技术的发展，人们越来越多地接触到中子辐射，尤其是在空间飞行和医疗卫生领域. 在医学领域，快中子治癌的研究始于1938年，迄今已有上万例癌症病人接受了快中子治疗. 大量临床试验表明，快中子对唾液腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、软组织肿瘤等的疗效明显优于光子[1]. 但是，快中子治疗也增加了正常组织的放射损伤，特别是晚期反应较重，限制了其治疗适应范围的扩大和疗效的提高. 因此，进一步加深对快中子辐射损伤与修复机制的研究是辐射医学领域的重要课题.

中子主要来源于反应堆、加速器和自发裂变，以及实验研究和临床上治疗恶性肿瘤用的中子源[2]. 中子是一种质量与质子相当的不带电粒子，具有很强的穿透力，能够释放出直接电离粒子或引起核反应. 中子在与组织物质作用过程中产生带电粒子，有一定能量的次级带电粒子能够引起电离和激发，从而使机体组织受到损伤[3]. 目前快中子辐射对动物损伤效应研究的实验数据还比较少. 因此，本研究对14 MeV快中子辐照大鼠后的损伤情况进行了全面研究，关注了造血与免疫系统、抗氧化系统的辐射损伤效应，为更全面的研究快中子辐射生物效应及其机制提供宝贵的实验数据.

1 实验材料、内容及方法

1.1 实验动物分组及模型建立

雄性Wistar大鼠，8周左右，体重230～260 g，SPF级动物房正常养殖3 d以适应环境，每只大鼠均在尾部标记，于实验前随机分为正常组和辐照组，每组各5只. 实验中每天观察大鼠的毛色、饮食和排泄状况，并记录其体重变化.

辐射在中国原子能科学研究院600 kV高压倍加器上使用直流束进行，束流强度为1 mA以上. 所用的反应为T(d，n)α，产生能量为14 Mev的单能中子. 实验中的中子注量是通过监测伴随α粒子的方法来实现的. 由中子的比释动能k(Gy/cm2)，中子注量Φ(/cm2)和中子在水中的吸收剂量的转换关系为D=k×Φ，因中子在水中的比释动能k=6.9×10-11Gy/cm2，经计算可得样品所受剂量. 辐照时，大鼠距离靶头14.1 cm，总剂量5 Gy.

利用14 MeV快中子对Wistar雄性大鼠进行5 Gy的全身照射后，分别在辐射后1，7，14 d 3个时间点对大鼠进行心尖取血，取血后以生理盐水心脏灌流，摘取胸腺、脾脏进行氧化应激水平检测.

1.2 骨髓有核细胞计数

骨髓有核细胞是指骨髓细胞中含有细胞核的细胞，骨髓细胞中除了成熟的红细胞和血小板外，其余细胞都有细胞核. 骨髓有核细胞的总数增多，则表示骨髓增生，如白血病、溶血性贫血、脾功能亢进等；骨髓有核细胞总数减少则表示造血组织功能减退，如再生障碍性贫血等[4]. 故本实验通过骨髓有核细胞计数来评估快中子对造血系统的损伤. 取大鼠两侧股骨，分别用1 mL的PBS冲出骨髓后，用PBS稀释20倍，用血细胞计数板计数.

1.3 抗氧化能力及激素水平测定

本实验抗氧化能力使用南京建成的丙二醛(MDA)测定试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)WST-1检测试剂盒和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒进行检测，具体操作参见检测试剂盒说明书.

1.4 数据分析

2 实验结果

2.1 14 MeV快中子辐射对大鼠白细胞及淋巴细胞的影响

表1显示了不同时间点大鼠外周血中白细胞总数、淋巴细胞总数、淋巴细胞比率的变化，并将快中子辐照组与正常组的实验结果进行了显著性差异比较.

以上结果发现，快中子辐照对外周血中白细胞造成了严重损伤，白细胞总数显著减少(p<0.01)，且难以恢复至正常水平. 在白细胞分类中，淋巴细胞对快中子辐射具有更高的敏感性，在辐照后淋巴细胞减少的比率大于白细胞总数减少比率，造成淋巴细胞比率减少. 但淋巴细胞恢复较快，照后第7 d即恢复正常. 而淋巴细胞总数受到整体造血功能的限制无法回到正常值.

时间/d1714组别白细胞计数/109淋巴细胞计数/109淋巴细胞比率/%正常组487±108393±0748140±918辐照组064±005∗∗∗038±007∗∗∗5730±1021∗∗∗正常组270±060188±0656936±941辐照组143±049∗∗093±028∗∗6675±1462正常组240±086198±0557550±490辐照组117±075∗125±007∗7907±247

注：*为与正常组比较，p<0.1；**为与正常组组比较，p<0.05；***为与正常组比较，p<0.01，以下同

2.2 14 MeV快中子辐射对大鼠红细胞及血小板的影响

表2显示了不同时间点大鼠外周血中红细胞总数和血小板数的变化，并将快中子辐照组与正常组的实验结果进行了显著性差异比较.

结果显示，辐照后第14 d快中子辐照组大鼠的红细胞总数约为正常组的6/7(p<0.01). 而照后第1，7 d，与正常组相比基本没有差异. 说明快中子对红细胞造成的损伤没有白细胞显著. 辐照后第1，7，14 d，辐照组大鼠的血小板总数均显著低于正常组. 其中，辐照后第1 d，辐照组大鼠血小板数开始减少，辐照后第7 d，血小板数继续减少，达到最低值，第14 d血小板数仍与正常组有显著差异(p<0.01)，说明快中子对血小板造成了严重损伤且较难修复. 这一结果与急性放射病造成的结果一致，说明血小板对高LET辐射同样敏感.

时间/d1714组别红细胞计数/1012血小板计数/109正常组874±062122840±17748辐照组850±10591200±19913∗∗正常组895±045118233±14408辐照组879±03925525±26586∗∗∗正常组904±050125750±9827辐照组771±028∗∗∗47450±28300∗∗∗

2.3 胸腺和脾脏的脏器指数变化

计算胸腺脏器指数和脾脏脏器指数，结果如图1(a)和1(b)所示.

从上述结果中可以看出，胸腺和脾脏都是对快中子辐射极为敏感的组织，辐照后脏器指数变化明显，胸腺于照后不同的时间显示出一定的损伤修复，但在本实验研究时间内始终未达到正常水平.

2.4 骨髓有核细胞计数结果

图1(c)为辐照后第14 d大鼠的骨髓有核细胞总数. 从图中可以看到，快中子辐照后，大鼠的骨髓有核细胞总数明显低于正常组(p<0.05). 由此可以得知，快中子辐射对骨髓造血系统造成了严重影响，且在本实验时间内无法恢复.

2.5 快中子对大鼠抗氧化功能的影响

以上结果显示，14 MeV快中子对大鼠免疫系统造成损伤，下面通过观察辐照后血浆、胸腺和脾脏的总抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量来评估快中子对大鼠免疫系统损伤的机制.

2.5.1 14 MeV快中子辐射后大鼠血浆中抗氧化功能变化

经过预实验，得出血浆稀释15倍可使SOD抑制率在40%～60%之间，故将样品用生理盐水稀释15倍再进行测定. 测得的吸光度值按说明书中的公式计算SOD活性、MDA的含量和总抗氧化能力，不同时间点大鼠血浆SOD活性、MDA含量和总抗氧化能力结果如图2所示.

结果显示，14 MeV快中子辐射后，大鼠血浆中SOD活性持续降低. 说明快中子辐射对大鼠超氧化物歧化酶的活性造成了影响，该影响随时间而日益严重. 而大鼠血浆中MDA含量持续升高，说明快中子辐射对大鼠抗氧化能力产生了较严重的影响，破坏了自由基的平衡，导致脂质过氧化产物的增多，该影响随时间而日益严重. 该变化与SOD活性的变化成负相关. 而14 MeV快中子辐射后第1 d，辐照组大鼠血浆的总抗氧化能力略有下降，无明显变化，至照后第7 d几乎没有差别，可能是因为其他非酶类抗氧化剂的调节起了作用.

2.5.2 14 MeV快中子辐射后大鼠胸腺中抗氧化功能变化

同理得不同时间点大鼠胸腺SOD活性、MDA浓度和T-AOC活性结果如图3所示.

结果显示，14 MeV快中子辐射后，大鼠胸腺中SOD活性、MDA含量和总抗氧化能力，相比对照组都升高(p<0.05)，且持续到辐照后第7 d. 说明快中子辐射对大鼠超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力的影响将长期存在.

2.5.3 14 MeV快中子辐射后大鼠脾脏中抗氧化功能变化

同样方法得到不同时间点大鼠脾脏SOD活性、MDA含量和T-AOC活性结果如图4所示.

结果显示，14 MeV快中子辐射后，大鼠脾脏中SOD活性、MDA浓度和总抗氧化能力，相比对照组，在辐射后第1 d没有显著变化，到辐照后第7 d却显著升高(p<0.01). 说明快中子辐射对大鼠脾脏超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力的影响在辐射后第7 d比较显著.

3 讨 论

随着人类对宇宙空间的深入探索以及中子在医疗卫生、科研应用及军事领域的广泛使用，使得人们越来越多地接触到中子辐射. 而中子作为一种高LET辐射，具有比低LET辐射更高的相对生物效应，诱发严重的DNA双链断裂、细胞凋亡以及细胞周期阻滞等[5]. 造血和免疫系统都是对电离辐射极为敏感的组织，低LET辐射对造血及免疫系统的损伤研究已经阐明了其损伤规律和特点，而中子辐射损伤的生物效应的研究则远远不够.

研究发现，5 Gy的14 MeV快中子辐射严重影响了大鼠外周血白细胞和淋巴细胞的比例，对淋巴细胞的抑制作用最为明显，并且难以修复. 其中照射后第1 d，白细胞和淋巴细胞数量降至最低，照后第7、14 d有所恢复，但仍不足正常组的1/2，可见损伤严重. 另外淋巴细胞是白细胞群体对快中子辐射最为敏感的一类，发现照后第1 d，淋巴细胞的比率明显降低，并且大鼠外周血血小板总数明显低于正常组，说明快中子对血小板造成了严重损伤且较难修复，这一结果，与谢漪[6]等研究发现小鼠受1 Gy X射线全身照射24 h后，外周血淋巴细胞比例显著减少的现象相符. 另外还发现，大鼠的骨髓有核细胞总数明显低于正常组，与正常组相差近一个数量级. 由以上结果，可以得出快中子辐射对骨髓造血系统和大鼠免疫系统造成了严重影响，且在本实验时间内无法恢复.

本实验中，注意到与辐射后7、14 d相比，辐射后1 d，正常对照组大鼠白细胞数显著升高(表1)，分析原因可能是由于免疫系统是对外界环境刺激非常敏感的系统，而麻醉、捆绑、长途运输等各种操作都会对其产生影响，导致应激反应引发的炎性白细胞增高，而随着时间的延长，应激性刺激的效应减弱直至恢复正常.

此外，通过观察胸腺、脾脏的脏器指数发现，快中子辐照后，胸腺和脾脏均出现萎缩，脏器指数明显减小. 其中胸腺脏器指数呈现先下降，而后回升，再下降的特点，这一结果与王宝勤等[7]研究发现小鼠受2.3 Gy裂变中子或相似致死剂量4.5 Gy γ射线照射后，其胸腺细胞数均出现急剧下降，而后回升，再出现第2次下降和第2次恢复的现象相符. 由胸腺和脾脏脏器指数的明显降低，可以得出快中子辐射对胸腺及脾脏造成了严重损伤，由此影响了大鼠免疫系统的正常工作.

机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系，其中超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于生物体内的氧自由基清除剂，而丙二醛MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度[8]. 本研究通过观察辐照后血浆、胸腺和脾脏中总抗氧化能力T-AOC、SOD酶活性及MDA值含量发现，14 MeV快中子对大鼠的抗氧化功能造成损伤，且持续到辐照后第7 d. 这一结果与彭洁等[9]研究发现小鼠受到5 Gyγ全身照射后，肝脏组织中的SOD活性降低、MDA含量增加，氧化应激损伤的现象相符.

4 结束语

快中子辐射可以通过损伤造血干细胞、影响造血微环境来对大鼠造血系统造成严重损伤，导致血小板、红细胞、白细胞、淋巴细胞的减少，从而，进一步影响机体的免疫及其他生理功能. 同时，快中子辐射还可以直接损伤胸腺和脾脏这两个重要的免疫器官，影响血浆、胸腺和脾脏的抗氧化应激能力，诱导细胞凋亡或坏死，造成胸腺和脾脏的萎缩，从而严重影响大鼠的正常免疫功能.

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(责任编辑：孙竹凤)

Radiation Damage to Rat Immune System Induced By 14 Mev Fast Neutrons

WANG Xiao1,2，YU Ying-qi2，ZHENG Jie-ying2，SHAN Zhen-gang1，LEI Run-hong1，SUI Li2，KONG Fu-quan2，CHEN Hong-tao2，DENG Yu-lin1，MA Hong1

(1.School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China;2.Department of Nuclear Physics，China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China)

In order to study the damage of immune system and antioxidant ability of rats induced by fast neutron, Wistar male rats were irradiated with 14 MeV fast neutrons on whole-body at the dose of 5 Gy. Wistar rats were randomly divided into control group and irradiation group. The blood, thymus, spleen and the oxidative damage (the level of SOD, MDA and T-SOD) were examined at 1, 7 and 14 d after radiation. Compared with the control group, the number of white cells and lymphocytes of rats reached to a minimum at the first day after irradiation, and after 7 and 14 d, was still less than the normal group. Platelet count began to decrease at first day, after exposure to seventh day, reaching a minimum value, and still had significant difference with that of the normal group at the fourteenth day. While the nucleated cell number in rat bone marrow after irradiation for 14 days was significantly lower than normal group. In addition, the thymus and spleen were shrinking, viscera index decreased significantly. The level of SOD, MDA and T-SOD of plasma, thymus and spleen increased in different degree. Results show that, fast neutron irradiation has effect on thymus, spleen and plasma, rising oxidative stress and apoptosis, resulting in spleen and thymus atrophy and a series of morphological changes, which seriously affect the immune function in rats.

neutrons; rats; radiation damage; immune system

2014-03-14

国家自然科学基金资助项目(31200636，11079054)

王潇(1966—)，女，研究员，E-mail：junmei33@ailiyun.com.

马宏(1974—)，女，副研究员，硕士生导师，E-mail：04656@bit.edu.cn.

Q 691.5

A

1001-0645(2016)07-0765-06

10.15918/j.tbit1001-0645.2016.07.020