基于截短表达的外膜蛋白P5的间接ELISA方法建立

李 淼李春玲宋 帅杨冬霞徐志宏

(1.广东省农业科学院兽医研究所，广东广州 510640；2.广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640；3.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)

基于截短表达的外膜蛋白P5的间接ELISA方法建立

李 淼1，2，3李春玲1，2，3宋 帅1，2，3杨冬霞1，2，3徐志宏1，2，3

(1.广东省农业科学院兽医研究所，广东广州 510640；2.广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640；3.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640)

为建立一种快速有效的检测副猪嗜血杆菌(HPS)抗体的方法，本研究选取之前研究中已验证具有良好抗原性和免疫原性的截短表达的重组外膜蛋白P5(P5F3)，将其纯化后作为包被抗原，建立了检测HPS抗体的间接ELISA 诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，为HPS 的快速诊断、免疫猪群抗体监测和HPS 流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

副猪嗜血杆菌；截短表达OMP P5；间接ELISA

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）作为一种常见菌类存在于猪的上呼吸道内，虽然只存在于上呼吸道内，但在一些特定的情况下可通过上呼吸道侵入机体，从而引起全身性疾病，而且病情严重，临床表现以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为特征。在断奶前后和仔猪成长期易感染该菌，5～8 周龄的仔猪最易感染，发病率较高，通常为 10%～15%，危害最重时，感染该病的仔猪死亡率在50% 以上。

目前，国内外学者主要采用IHA 和ELISA这两项来HPS 抗体进行检测，两种方法唯一不同的是抗原的制备方法。但由于HPS抗原培养过程中存在散毒可能，对研究人员存在危险，且全菌体抗原的成分过于复杂，使其在临床诊断中无法得到广泛应用，因此，建立一种精准、无害、实用的检测方法具有重要的意义。

本研究利用之前获得的截短表达的 HPS 外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）P5 作为包被抗原建立了间接 ELISA 方法，并对 ELISA 的反应条件进行了优化，为 HPS 诊断试剂盒的研制提供了有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株、血清及生化试剂

pET32a-P5F3 重组菌由本实验室构建、保存。兔抗 HPS 阳性血清及猪抗 HPS 阳性血清用 HPS 标准菌株接种新西兰大白兔或猪制得，由本实验室 -80℃ 保存。兔抗 HPS 阴性血清为健康兔血清；猪抗 HPS 阴性血清为从本实验室饲养的未进行 HPS 疫苗免疫的健康猪中采集；猪链球菌（SS）、猪染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、猪多杀性巴氏杆菌（PM）阳性血清由兰州兽医研究所惠赠；猪大肠杆菌（E. coli）阳性血清购自中国兽医药品监察所；猪伪狂犬病病毒（ADV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）阳性血清均为 IDEXX 试剂盒中的标准阳性血清。待检血清为从广东地区河源、增城、佛山等猪场采集的猪血清。

牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪及羊抗兔 IgG 购自北京鼎国试剂公司，96 孔酶标板购自美国costar。

1.2 重组蛋白 P5F3 的纯化

将阳性重组菌液 pET32a-P5F3 按照 1：50 的比例接种到含100 µg /ml氨苄青霉素的5 ml LB 液体培养基中，37 ℃ 250 r /min振荡过夜后，按 1：100 的接种量转接到 500 ml新鲜 LB 液体培养基中，培养至 OD600nm值达到0.5～0.7时，加入诱导剂（IPTG）至终浓度为 0. 5 mmol / L，于 37 ℃ 诱导表达 4 h 后收集菌液。将培养物于 4 ℃，9 000 r /min 离心 10 min，弃上清，以适量 PBS 重悬沉淀，超声裂解菌液，4℃，9 000 r /min离心10 min。

利用常规方法进行蛋白纯化。

1.3 间接ELISA方法的操作程序

将重组蛋白抗原用碳酸盐缓冲液稀释到适当浓度，每孔100 µl加入到 96 孔酶标反应板中，4 ℃包被过夜。用 PBST 洗涤 3次，每孔 250 µl，每次 3 min；用 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭反应孔，每孔 200 µl，于 37 ℃ 作用 2 h，洗涤 3 次。加入适当比例稀释的血清，每孔 100 µl，于 37 ℃ 作用 30 min，洗涤 3次；加入适当比例稀释的酶标二抗，每孔 100 µl，37 ℃ 作用 30 min，洗涤 3 次；加入 TMB 底物显色液，每孔 100 µl，室温避光反应 10 min。加入 2 mol/L H2SO4终止反应，每孔 100 µl。置酶标仪上测定每孔的 D450nm值。

1.4 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定

本研究中，重组蛋白抗原的最佳工作浓度和待检血清的最佳稀释度是采用了方阵滴定法进行的确定。

重组蛋白抗原的最佳工作浓度的确定方法：将纯化的重组P5F3 蛋白用用碳酸盐缓冲液进行倍比稀释，比例分别为 1：20、1：40、1：80、1：160 和 1：320，每孔 100 µL 包被反应板，每个稀释度设 8个重复操作孔。

待检血清的最佳稀释度的确定：对猪抗 HPS 阴、阳性血清进行倍比稀释，比例分别为 1：20、1：40、1：80 和 1：160，每个血清稀释度对应 5 个抗原包被浓度，将酶标山羊抗猪 IgG 按 1：5 000 稀释。

按间接 ELISA 的操作程序，用酶标仪测定每孔的D450nm值，计算阳性血清孔的平均D450nm值（P）和阴性血清孔的平均D450nm值（N）之比值（P/N）。

1.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定

将1.4中确定的最佳抗原包被浓度与血清稀释倍数，将二抗分别作倍比稀释，比例分别为1：2 000、1：4 000、1：6 000、1：8 000、l：10 000，每个稀释度设两个重复孔，进行间接ELISA测定。判定标准同上，确定酶标二抗的最佳工作浓度。

1.6 间接ELISA方法的优化

应用方阵滴定法进一步对抗原包被条件、封闭条件、血清及酶标抗体作用时间和显色条件等 ELISA 参数进行优化。确定间接ELISA 的操作过程如下：将重组蛋白抗原用包被液稀释至最佳浓度后包被 96 孔酶标板，100 µl/孔，4℃包被过夜；甩掉包被液，用PBST洗涤 3 次，每次 3 min；以 0.5% 的 BSA 封闭液 37℃ 封闭2 h，洗涤；将血清样品稀释至最佳稀释度后，100 µl/孔，37℃温育30 min，洗涤，拍干；将HRP标记的羊抗猪 IgG 按照1：6 000进行稀释，每孔加入 100 µL，37℃ 温育 30 min，洗涤，拍干；

再用 PBST 洗涤，拍干；加入 100 µl TMB 显色液，避光显色 8 min，最后加入 100 µl 终止液（2 mol/L H2SO4）终止反应，用酶标仪检测D450nm值，计算D450nm，P/D450nm，N（阳性／阴性）值。

1.7 间接ELISA阴阳性临界值的确定

选取 60 份 HPS 阴性血清进行间接 ELISA 检测。计算平均D450nm（X）值以及标准差（SD），确定阴性血清临界值 ≤ X + 2SD，阳性血清临界值 ≥ X + 3SD。

1.8 特异性试验

利用建立的 ELISA 方法分别对 HPS 血清型 4、5、12和13 型兔阳性血清（二抗为HRP 标记的羊抗兔 IgG）和其他病原，包括SS、 APP、 E.coli.、PM、CSFV、PRRSV 和 PCV-2等的阳性血清进行检测，观察是否存在交叉反应，验证所建立 ELISA方法的特异性。

1.9 重复性试验

批内重复性试验：选取 8 份 HPS 抗体水平不同的血清，在相同试验条件下，每份血清样本平行做 8 个重复，用 ELISA 检测，对检测结果进行统计学分析。

批间重复性试验：选取 8 份 HPS 抗体水平不同的血清，在相同试验条件下，在 4 个不同时间用 ELISA 检测，对检测结果进行统计学分析；在相同试验条件下，用 4 批不同时间纯化的重组抗原进行 ELISA 检测，对检测结果进行统计学分析。

1.10 符合率实验

选取经间接血凝试验（IHA）检测结果为阳性和阴性的血清样本共460份，进一步用所建立的间接 ELISA 方法检测，以 IHA检测结果为标准，计算间接 ELISA 相对于IHA的符合率。

1.11 临床血清的检测

采用建立的间接ELISA方法对从广东地区河源、佛山、增城、惠州、广良、朱村等猪场采集的猪血清进行 HPS 抗体的检测。

2 结果

2.1 P5F3 的纯化及鉴定

对纯化的 P5F3 进行 SDS-PAGE 检测，进一步利用 Western blot 分析其免疫原性，如图1 所示，目的条带所在的位置出现明显的特异性条带，大小与预期一致，证明纯化的产物与 HPS 阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。

图1 纯化的 P5F3 的 Western blotting 分析

2.2 抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定

方阵滴定的结果显示，当血清稀释度为1：120，抗原包被浓度为 2.5 µg/mL，每孔100 µL（即每孔包被抗原为250 ng），P/ N值相对较大，结合阴性、阳性血清的 D450nm值，确定 2.5 µg/mL为抗原最适包被浓度，1∶120为血清最适稀释浓度（见表1）。

2.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定

在最佳抗原和血清稀释度反应条件下，将酶标二抗分别以1∶2 000、l∶4 000、1∶6 000、1∶8 000和 l∶10 000 倍稀释，如表 2 所示，根据 D450nm值读数和 P/N 值判断，酶标二抗的最佳工作浓度为 1∶6 000，此时 P/N 值最大。

表2 酶标二抗最佳工作浓度的确定

2.4 间接ELISA阴阳性临界值的确定

根据对 60 份 HPS 阴性血清进行间接 ELISA 检测的结果，得出阴性样品平均 D450nm值（X）= 0.1127，标准差（S）为 0.0465。所以当样品 D450nm≥ X + 3SD即 0.252 判为阳性；样品 D450nm值 ≤X + 2SD 即 0.206 判为阴性；0.206 < 样品 D450nm值 < 0.252 判为可疑，可疑样品重新检测，仍为可疑则判定为阳性。

表1 抗原最适包被浓度及血清最适稀释度的方阵滴定结果（P/N值）

表3 间接ELISA的特异性试验结果

表4 批内重复性试验结果

表5 不同时间批间重复性试验结果

表6 不同批次重组抗原批间重复性试验结果

2.5 特异性试验

以阴性血清作为对照，用 P5F3 作为抗原建立的间接 ELISA方法检测抗原与 HPS 血清型 4、5、12 和 13 型交叉反应，结果显示，P5F3 与各血清型阳性血清均呈阳性反应，表明建立的 ELISA方法能检出我国主要流行的血清型的 HPS 抗体。而利用该方法检测SS、APP、E.coli、PM、ADV、CSFV、PRRSV 和 PCV-2 阳性血清，被检血清的 D450nm值均低于0.206，呈阴性反应（见表3），表明建立的 ELISA 方法具有良好的特异性。

2.6 重复性试验

统计结果显示，批内重复性试验的变异系数小于 5 %（表4），不同时间、不同批次重组抗原的批间重复性试验变异系数均小于 10 %（表5、表6）。说明所构建的 ELISA 方法具有良好的重复性。

2.7 符合性试验

经 IHA 检测结果为阳性的 297 份血清样本，间接 ELISA 检出阳性 291 份，阴性 6 份；IHA 检测结果为阴性的 163 份血清样本，间接 ELISA 检出阴性 158 份，阳性5份。相对于HI 的符合率为 93.1 %。

2.8 临床血清检测应用

利用建立的间接 ELISA 检测方法，对未进行 HPS 疫苗免疫的健康猪场采集的 1100 份猪血清样品进行检测，共有 162 份阳性样品，阳性率为14.7%。

3 讨论

近年来副猪嗜血杆菌病已成为生产上最常见以及造成经济损失最大的猪传染病之一。为了有效地控制该病的流行，准确地诊断至关重要。目前，进口的 HPS ELISA 检测试剂盒价格昂贵，因此，研制一种操作简便、特异和敏感的检测方法是十分必要的。

间接ELISA 方法操作快速简单，对于疾病的诊断、检疫及流行病学调查具有较高实用价值。选择合适的包被抗原是建立间接ELISA 检测方法的关键，有研究学者选用荚膜多糖、全菌体作为包被抗原分别建立的检测抗体的间接 ELISA 方法，但检测结果不稳定且经常出现假阴性。而免疫原性良好的菌体蛋白经体外高效表达后，常被选为各种血清学诊断方法所用的抗原。Omp P5是革兰氏阴性菌的一个主要外膜蛋白，具有宿主粘附结构区域和免疫原性。研究表明，HPS Omp P5 能够参与细菌的定植，也是机体免疫应答反应的早期抗原，在自然感染或弱毒活疫苗免疫后的动物中都可以检测到针对P5 蛋白的抗体，因此具有重要的诊断价值。

我们在之前的研究中选择 pET32a 原核表达载体，分段表达了 HPS 的 OMP P5 蛋白，经免疫印迹试验证实所截短表达的 P5F3蛋白可与 HPS 阳性血清反应，表明重组 P5F3 蛋白具有良好的免疫反应反应性与特异性。因此，本研究中我们选取纯化后的 P5F3作为包被抗原建立间接 ELISA方法。通过对抗原、血清包被浓度和作用时间、酶结合物稀释浓度和作用时间、抗原抗体结合时间、封闭时间、底物显色时间等条件的优化，建立了 HPS 间接ELISA 抗体检测方法。通过对血清样品的检测证实间接 ELISA 具有简单，快速，敏感，稳定性和重复性好的特点，可用于 HPS 的快速诊断。

[1] 魏子贡，蔡旭旺，金梅林，等.副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2006，36（9）：713-718.

[2] 谢乐新，李淼，宋帅，等.副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的分段表达及免疫学性质分析[J].华北农学报，2013，28（5）：48-52.

广东省公益研究与能力建设专项资金项目（2014B070 706011）、广东省科技创新创业人才服务领域（2015A020 224022）、广东省农业科技重点项目（2015B020203004）

李淼（1982—），女，博士，助理研究员。

徐志宏（1965—），男，硕士，研究员。