基于化学指纹图谱的茶树新品系丽早香识别研究

2016-11-24潘建义王丽鸳马军辉陈香云

浙江农业学报 2016年10期

潘建义，成浩，王丽鸳，马军辉，陈香云

(1.浙江省丽水市农业局农作物站，浙江丽水323000； 2.中国农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心，浙江杭州 310008； 3.江苏省南京市高淳区林业工作站，江苏南京211300)

潘建义1，成浩2，*，王丽鸳2，马军辉1，陈香云3

化学指纹图谱技术应用于茶树研究可用于其身份、产地的判别。茶树品种间差异鉴别是申请农作物新品种审定的重要内容，试验利用HPLC检测分析丽早香、龙井43、迎霜和当地群体的化学组成及比例，构建化学指纹图谱，从而区分丽早香品系。通过HPLC测定样品色谱数据，选择90%以上样品中存在的峰为样本集的共有峰，建立数字化多元化学指纹图谱。丽早香在图谱相似性上与当地群体最高；在儿茶素、咖啡碱、没食子酸等茶叶主要化学组成比例上，与对照不同，可以与龙井43、迎霜、当地群体辨别区分，为茶树品种间差异鉴别和申请植物新品种保护提供借鉴。

茶树；丽早香；化学指纹图谱；识别分析

化学指纹图谱技术在中药等领域用于评价材料品质、道地性、产地等已有许多成功的应用案例[1-3]。近年来，该技术在茶树上应用研究并用于身份、产地判别已经有相关报道[4-11]。丽早香是浙江丽水市选育出来的早生茶树新品系，其早生优质特别适制螺形显毫名茶(如金奖惠明、苏州碧螺春、南京雨花茶)和扁形名茶、半烘炒香茶等名优绿茶和工夫红茶，该品系多适制性在生产上给茶农带来良好经济效益而为茶农迅速接受，具有较大开发利用价值。本文运用HPLC建立多元化学指纹图谱，并结合判别技术，明确丽早香与其他品种特别是主栽品种的差异，为茶树品种间差异鉴别提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验采用干茶样本材料76个，由浙江省丽水市莲都区、景宁县、遂昌县、松阳县、缙云县等地的13个茶场(厂)以扁型茶制作工艺加工制作，原料品种除了丽早香(LZX)外，以本地主栽品种龙井43(LJ)、迎霜(YS)和当地鸠坑群体种(QT)作为对照；鲜叶采样标准为春季第一轮新梢的一芽一叶相同品种随机采样；茶样制作完成后冷藏干燥保存备用。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent 公司，含四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器)；DK-S24 型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；表没食子酸儿茶素( EGC，纯度>99%) 、儿茶素( C，纯度>99%) 、表儿茶素(EC，纯度>99%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，纯度>99%)、表儿茶素没食子酸酯(ECG，纯度>99%)、咖啡碱(Caffeine，纯度>99%)、没食子酸(GA)均购自美国Sigma公司；色谱乙腈(德国Merck公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取方法

参考王丽鸳等[5-6]方法，干茶样粉碎后，精密称取3 g，50%乙醇室温浸提15 min，过滤，滤渣洗涤3次后合并滤液，用容量瓶定容至100 mL[12]，过0.22 μm滤膜，所得滤液用于HPLC分析。

1.3.2 HPLC方法

Phenomenex C12色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；色谱条件：(1)A相为1%甲酸；B相为乙腈；梯度从4% B到25% B，流速1 mL·min-1，60 min，检测波长 280 nm；(2)A相为1%甲酸；B相为乙腈；梯度从10% B到30%B，流速1 mL·min-1，60 min。柱温40 ℃，检测波长365 nm[6]。

1.3.3 指纹图谱的建立

获得色谱图后，每个样本的2个色谱图分别以峰面积相对最大之主峰为参照，计算相对保留时间和相对峰面积；各峰按相对保留时间一一匹配后，选择90%以上样品中存在的峰为样本集的共有峰，按多元信息融合原理将两色谱图以串行方式进行像素级融合，最后选择41个色谱峰数据建立起各样本的数字化多元化学指纹图谱[5-6,12]。

1.3.4 组成比例、模式图谱与相似度计算

样本材料按品种分为4组，求取同组样本的平均值和标准差，Excel作图分析。用同组样本的平均值构建该组样本的模式图谱；利用SPSS软件，采用向量夹角法测算样本与模式图谱间或样本间的相似度[5-6,12]。

1.3.5 品种间差异与判别分析

每组样本以每隔3个样本留1个的方法留出验证样本，其余作为训练样本，进行品种差异与判别研究。利用SPSS软件，根据统计量Wilksλ最小值原则选择变量，进行逐步判别分析并建立判别方程；接着通过训练样本的回代判别并计算回代错判率，将每一样本逐一从训练集中去掉，再用同样方法判别分析，进行内部交叉验证分析，验证所建立方程的稳定性。最终利用外部验证样本验证判别方程的判别效果[4]，并采用判别方程数据作图。

2 结果与分析

2.1 样本色谱间的相似度

将各样本按品种分组后，计算出各品种的平均色谱数据，然后利用SPSS软件以向量夹角法计算出各样本与各品种平均色谱间的相似度，分析相关数据，可以看到绝大部分样本都和其本身所属的品种平均色谱间的相似度最高，经数据分析剔除2个异常样本后，各品种平均色谱的峰面积和相对峰面积见表1。按同样原理，计算出各品种平均色谱之间的相似度见表2。从表中可以看出，4个品种材料间相似度最高的是丽早香和当地鸠坑群体种，其次是龙井43和当地鸠坑群体种，相似度最低的是龙井43和迎霜。

表1 各茶树品种平均色谱的峰面积和相对峰面积

Table 1 Average chromatographic peak area and relative peak area of each tea variety

峰编号PeakNo.LJPARA/%QTPARA/%YSPARA/%LZXPARA/%X1234.582.8297.563.2346.293.0189.142.2GA1060.9712.7937.019.81034.078.6571.307.5X31509.3218.11328.7013.91526.6712.71272.1416.2X4215.532.7388.374.0398.193.3433.395.1EGC220.762.6184.191.9210.951.7186.292.4X7292.483.5257.192.8297.322.5214.632.7C266.393.2213.812.2213.171.8204.642.7X91168.8314.01456.5115.61090.449.1753.039.7caf7883.6294.68163.4785.18601.4671.57608.1095.8X12162.442.0237.372.4312.522.6157.091.9EC717.058.6544.415.7541.314.5687.119.1EGCG8366.95100.09710.87100.012108.66100.08256.62100.0X15482.495.8406.734.2246.272.0277.113.7GCG427.395.2285.823.0388.493.2323.224.2X171866.0122.31349.0314.32663.7922.91245.6115.1X18481.355.7579.546.2455.153.8205.852.6X21961.9811.2210.112.3202.601.7405.385.2X22368.484.4318.793.4263.632.2327.544.2ECG5486.3065.74187.3243.93157.6526.14862.9762.3X31247.1535.6206.8637.8115.7030.5193.3552.4X3270.9810.5107.6419.185.5822.2118.2733.9X33163.1723.1170.6030.744.6511.395.9124.4X34153.9423.5268.3148.7346.1591.3248.6071.4X35288.2542.8371.5973.7330.5691.4251.0874.5X36698.56100.0540.65100.0367.68100.0386.70100.0X37231.7833.9230.6742.057.8115.2183.0150.7X3842.147.1113.4820.866.7717.8145.4745.0X39252.1238.6420.8278.1847.71227.0486.42145.3X40321.8346.8253.4046.8154.0641.1293.4982.4X4131.655.276.2113.783.6422.2141.8744.9

LJ，龙井43；QT，当地鸠坑群体种；YS，迎霜；LZX，丽早香；PA，峰面积；RA，相对面积。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang; PA， Peak area; RA， Relative area.

表2 各茶树品种平均色谱间的相似度

Table 2 The degree of similarity between average chromatographic data of each tea variety

品种VarietyLJQTYSLZXLJ1.0000.9490.7190.851QT1.0000.8710.952YS1.0000.930LZX1.000

LJ，龙井43；QT，当地鸠坑群体种；YS，迎霜；LZX，丽早香。

LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang.

2.2 生化组成与比例

图1所示的是各品种的儿茶素单体含量，以及它们的没食子酸和咖啡碱含量。从图中可以看出，各品种之间相差较大的主要是EGCG和ECG等酯型儿茶素成分含量，其中迎霜的EGCG含量较高，同时ECG含量相对较低。而丽早香的两种酯型儿茶素含量均与龙井43在一个等级上，EGCG低于迎霜，而ECG高于迎霜。

LJ，龙井43；QT，当地鸠坑群体种；YS，迎霜；LZX，丽早香LJ，Longjing 43； QT，Qunti； YS: Yingshuang； LZX，Lizaoxiang图1 各茶树品种的儿茶素单体、没食子酸和咖啡碱含量Fig.1 The contents of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

图2所示的是4个品种的儿茶素单体、没食子酸和咖啡碱构成比例。从图中可以看出，组成比例最为稳定的成分是咖啡碱，不论哪个品种都是34%左右。组成比例变化最大的是EGCG，其幅度为35%～47%。而丽早香各成分组成比例与龙井43比较相似，与迎霜相差较大。

2.3 各茶树品种模式图谱的建立

将2个色谱图按信息融合原则进行合并后，计算出相对保留时间和相对峰面积，按相对保留时间对每个样本的色谱峰进行一一匹配后，选择90%以上样本共有的峰为样本集共有峰，并去除相对峰面积过小的峰，最终得到每个样本的化学指纹图谱并通过求取平均构建各组样本的模式图谱如图3。从这些模式图谱中可以比较形象直观地看出各个不同品种在生化组成方面的差异。

LJ，龙井43；QT，当地鸠坑群体种；YS，迎霜；LZX，丽早香LJ， Longjing 43; QT， Jiukeng; YS， Yingshuang; LZX， Lizaoxiang图2 各茶树品种儿茶素单体、没食子酸和咖啡碱比例Fig.2 The proportion of catechin monomer， garlic acid and caffeine of each tea variety

图3 各茶树品种的模式图谱比较Fig.3 Fingerprint pattern of each tea variety

2.4 品种差异的判别

采用各品种组选出的训练集样本，利用SPSS软件计算进行逐步判别分析，根据计算得出的非标准化判别方程系数，得到判别方程组，包含3个判别方程，它们的变量和各项系数见表3。判别函数F1、F2和F3的特征值分别为96.46、35.81和16.33，典型相关系数分别为0.995、0.986和0.971，对判别结果的方差分析表明，类间差异明显(P<0.0001)，即判别结果有效。

将57个训练集样本再逐一代入判别方程，所有的样本都成功地判别为其正确的品种，回判成功率为100%。再将每一样本逐一从训练集中去掉后，重新建立判别方程组并做判别分析，进行内部交叉验证分析，用于验证建立的方程组的稳定性，所有样本的内部交叉验证都成立，其正确率同样是100%。最后将17个外部验证样本逐一代入进行判别分析，只有一个丽早香的样本被错判为当地鸠坑群体种，正确判别率为94.1%。分析错误原因，主要是丽早香的有效样本数量只有8个，数量太少，因此它的训练集还没能完全综合出这个品种的特性。

训练集和验证集样本的判别结果和判别函数X3、X9、EC……X41分别代表不同相对保留时间色谱峰的相对峰面积。

表3 逐步判别分析得到的判别方程式组的各项系数

Table 3 The coefficient of discriminant equation group by Stepwise discriminant analysis

自变量Independentvariable系数Coefficient方程式1Formula1方程式2Formula2方程式3Formula3常数项-23.24-5.074.99X327.9117.53-24.62X9-19.2716.0052.79EC135.8380.0027.06X18-48.48-65.18-30.10ECG7.60-9.23-24.00X3114.29-0.36-8.29X32-21.71-14.8219.60X37-20.43-3.28-1.86X3854.1325.2536.48X39-4.906.43-4.17X4029.69-10.418.35X41-14.713.17-24.00

X3，X9，EC……X41 represents the relative peak area at different relative retention time， respectively.

得分见表3，为更直观体现判别分析的结果，将3个判别函数的得分值两两作图(图4)，从图4可以看出，判别分类的效果很好，不同的品种都分布在不同的区域，相互间的界限明显，只有被错判的那个丽早香样本的位置与其他丽早香样本较远。

图4 判别函数得分值的分布图Fig.4 The layout of score values of discriminant function

3 结论

研究结果表明，从儿茶素单体组成来看，丽早香与龙井43比较接近，但从整个化学指纹图谱的相似性来看，丽早香与当地鸠坑群体种的相似度更高，与生产实践中反映的丽早香感官品质色香味形及适制性与当地鸠坑群体相当这一现象一致。从化学指纹图谱模式图上，可以清楚地看出丽早香与龙井43、当地鸠坑群体种和迎霜在主要生化组成与比例上不同。通过判别分析，可以将丽早香与其他3个品种的样本很好地辨别区分。

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(责任编辑张韵)

Identification and characterization of new tea line Lizaoxiang based on chemical fingerprint

PAN Jian-yi1， CHENG Hao2，*， WANG Li-yuan2， MA Jun-hui1， CHEN Xiang-yun3

(1.CropWorkstationofAgricultureBureauofLishui，Lishui323000，China; 2.TeaResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China; 3.ForestWorkstationofGaochunDistrictofNanjing，Jiangsu，Nanjing211300，China)

Chemical fingerprint technology has widely been implicated for discriminating the identity and origin of tea plant. Difference identification between tea plant cultivars is important for applying for new variety certification. In the current study， we analyzed the chemical composition and proportion of bioactive compounds using HPLC and built a chemical fingerprint to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. On the basis of the obtained HPLC chromatographic data， we selected common peak data of more than 90% samples to build chemical fingerprint chromatograph for further analysis. Chromatography revealed that Lizaoxiang was closest to Jiukeng；while the proportion of catechins， gallic acid and caffeine was different from that of Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng. These observations help to distinguish Lizaoxiang from Longjing 43， Yingshuang and Jiukeng， and thus provid reference to characterize the difference between the varieties of tea plant for new variety protection.

tea; Lizaoxiang; chemical fingerprint; identification analysis

http://www.zjnyxb.cn潘建义，成浩，王丽鸳，等. 基于化学指纹图谱的茶树新品系丽早香识别研究[J].浙江农业学报，2016，28(10)： 1724-1729.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.14

2016-06-16

浙江省茶产业重点科技创新团队(2011R50024)；丽水市优质特早红绿兼制型茶树新品种选育研究(2014XPZ11)

潘建义(1968—)，男，浙江温州人，硕士，高级农艺师，主要从事茶叶技术推广及茶树品种研究。 E-mail: pjy369@126.com

*通信作者，成浩，E-mail: chenghao@mail.tricaas.com

S571.1

1004-1524(2016)10-1724-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1724-1729