cRGD环肽修饰的脂质体靶向肺癌细胞A549的体外研究

张志强，马海英，李运霞，杨艳荣，赵欣

cRGD环肽修饰的脂质体靶向肺癌细胞A549的体外研究

张志强，马海英，李运霞，杨艳荣，赵欣

目的构建一种整合素cRGD环肽修饰的脂质体（cRGD-LP）并用于靶向A549细胞的研究。方法采用薄膜分散法制备cRGD-LP，测定其粒径和电位，用流式细胞仪考察A549细胞对其的摄取，激光共聚焦显微镜考察cRGD-LP的肿瘤球穿透能力。结果构建的cRGD-LP粒径为（112.3±7.8）nm，粒径分散系数（PDI）为0.023±0.045，电位为（2.38±0.87）mV，且24 h内有良好的血清稳定性，粒径保持在115 nm左右。A549细胞对cRGD-LP的摄取是PEG修饰脂质体（PEG-LP）的1.7倍，且cRGD-LP对A549肿瘤球的穿透能力比PEG-LP高，能穿透至肿瘤球的深部。结论构建的cRGD-LP具有良好的靶向A549细胞的能力，是一种潜在的新型给药系统。

肺癌；整合素；cRGD；脂质体

肺癌在中国的发病率和致死率近年来呈急剧上升的趋势［1-2］。目前，针对肺癌主要包括化疗和手术治疗两种方式。由于化疗药物的副作用和缺乏组织选择性，使得肺癌的化疗效果大大折扣。因此，如何克服化疗药物的这两种局限性成为研究的重点。

在众多给药系统中，由于脂质体既可以包载脂溶性药物，又可以包载水溶性药物，并具有高稳定性，使得其在肿瘤治疗中倍受青睐［3］。将药物包裹在脂质体中可以大大减少药物的毒性，如将紫杉醇包裹在脂质体中，可以大大减小其心脏毒性，从而减轻化疗带来的副作用［4］。聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体可以通过肿瘤增强渗透滞留效应（EPR）靶向到达肿瘤部位。与没有PEG修饰的脂质体相比，PEG修饰的脂质体可以使更多化疗药物蓄积在肿瘤部位，从而增加其疗效［4-5］。但是，这种脂质体由于缺乏组织选择性，其治疗效果仍远远达不到期望的效果。针对这一现象，构建一种可以主动靶向于肺部的脂质体给药系统能够显著提高化疗的效果，并且减少其副作用。在非小细胞肺癌细胞A549中，研究人员发现整合素αvβ3受体高表达［6］，因此利用cRGD序列可以与整合素受体αvβ3结合这一优势［7］，将cRGD修饰在脂质体表面，构建主动靶向的脂质体给药系统应用在肺癌治疗中，从而产生更好的治疗效果。

基于上述研究背景，本研究构建由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）修饰的cRGD环肽脂质体（cRGD-LP），通过体外的脂质体构建、稳定性考察、细胞摄取和肿瘤球穿透试验的考察，期望所构建的cRGD-LP可以高效地主动靶向肺癌细胞，增加其抗肿瘤效果。

1 材料与仪器

ZS90粒径电位测定仪（英国，Malvern），流式细胞仪（美国，BD），激光共聚焦扫描显微镜（德国，Leica），A549细胞（ATCC），cRGD（上海吉尔多肽有限公司，纯度95%），DSPE-PEG2000-NHS（西安瑞禧生物科技有限公司），DSPE-PEG2000-OMe（上海艾韦特医药科技有限公司），磷脂SPC和胆固醇Chole（北京奥博星生物技术有限责任公司），异硫氰酸荧光素标记的磷脂（FITC-PE，美国Sigma），DAPI（碧云天生物技术有限公司），DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国，Gbico），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 DSPE-PEG2000-cRGD的合成［7］准确定量称量cRGD和DSPE-PEG2000-NHS（摩尔比为2∶1），分别溶解于无水二甲基甲酰胺（DMF）中，二者混合室温避光反应48 h；之后混合液加入透析袋中（截留分子量1000），超纯水透析48 h后，取出透析袋中液体冻干，得纯化后的DSPE-PEG2000-cRGD。

2.2 脂质体的制备［4］本课题制备两种脂质体，其中PEG-LP通过SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-OMe摩尔质量比为3∶2∶0.05比例制得，cRGD-LP通过SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-cRGD摩尔质量比为3∶2∶0.05比例制得。两种脂质体制备方法如下：将所有脂质体材料溶解于氯仿甲醇混合液（V/V=2∶1）中，室温旋蒸抽干成薄膜，真空干燥过夜，用PBS室温水化15 min，探头超声40 s制得。对于FITC标记的脂质体，将定量FIPE-PE加入脂质体材料中，与脂质材料一起抽膜制得。

2.3 粒径和电位的测定所制得的两种脂质体均用超纯水以1∶10稀释至1 ml，用粒径电位仪分别对其粒径和电位进行测定。结果如表1所示，两种脂质体PEG-LP和cRGD-LP的粒径均在100 nm左右，PDI均＜0.3，说明该两种脂质体显示了良好的均一性。从电位测定结果看，PEG-LP略带负电荷，cRGD-LP略带正电荷，但均接近电中性，说明两种脂质体都具有高稳定性。

表1 不同脂质体的粒径与电位（n=3）

2.4 血清稳定性测定分别吸取两种制备的脂质体1 ml，加入到过滤后的胎牛血清（FBS）1∶1混合，所得到的脂质体血清混合物在37℃下孵育，分别于0、1、2、4、8、12和24 h各吸取100 μl，用超纯水稀释到1 ml，对其粒径进行测定。结果如图1所示，此两种脂质体与FBS混合后，在24 h之内，cRGD-LP粒径维持在115 nm左右，PEG-LP粒径保持在100 nm左右，表明在体外模拟条件下，此两种脂质体均具有较高的血清稳定性，有利于脂质体的体内研究。

图1 不同脂质体的血清稳定性（n=3）

2.5 体外细胞摄取［8］将A549细胞以10万/孔接种在6孔板中，等细胞完全贴壁后，继续生长24 h，直到每孔细胞汇合度达到约80%。将所制得到的FITC标记的两种脂质体各100 μl加入到6孔板中，再加入900 μl DMEM培养基，使得每孔FITC含量为3 μg/ml。37℃继续孵育4 h，将细胞用PBS洗3次，胰酶消化，将每孔细胞重悬在300 μl PBS中，用流式细胞仪进行测定。结果表明，A549细胞对cRGD-LP摄取的荧光强度是PEG-LP的1.7倍（P＜0.05，图2），说明cRGD-LP有利于A549细胞的摄取，更易靶向至肿瘤细胞，因此可以使得肿瘤治疗效果显著增加。

图2 A549细胞对不同脂质体摄取结果（n=3）

细胞摄取定性实验：将A549细胞如上述方法与两种脂质体孵育4 h后，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染色10 min，再用4%的多聚甲醛固定，激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。结果表明（图3），FITC标记的cRGD-LP组的荧光强度显著高于PEG-LP组。该结果与流式细胞仪定量摄取的结果一致，两者均表明与PEG-LP相比，cRGD-LP可以更好的靶向A549细胞。

图3 激光共聚焦显微镜观察A549细胞对不同脂质体的摄取（n=3）

2.6 肿瘤球穿透性实验［9］用无血清的DMEM配置2%的琼脂糖凝胶，将此凝胶80℃下加热至融化，以每孔100 μl接种在96孔板中。待其冷却至室温形成固体后，消化A549细胞，以每孔8000个接种在96孔板中。待肿瘤球成形长至直径为200～300 μm后，将FITC标记的两种脂质体加入到96孔板中，使得每孔FITC含量为3 μg/ml。继续37℃孵育4 h后，将肿瘤球吸出，用PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min后，在激光共聚焦显微镜下考察两种脂质体肿瘤球穿透能力。结果表明（图4），FTIC标记的cRGD-LP组的荧光强度高于PEG-LP组，并且在肿瘤球的深部，cRGD-LP组的荧光强度高于PEG-LP组，说明cRGD-LP对A549肿瘤球的穿透能力强于PEG-LP，cRGD-LP比PEG-LP穿透进入肿瘤球深部，更能靶向至深处的肿瘤细胞。

图4 不同脂质体对A549肿瘤球穿透能力（n=3）

3 讨论

在化疗中，尽管PEG修饰的脂质体可以被动靶向到肿瘤细胞，但缺乏对癌症细胞的主动识别能力。整合素作为真核细胞的特异性表达受体，高表达在A549肺癌细胞中。构建整合素修饰的给药系统，可以比传统PEG修饰的给药系统更好的靶向癌症病灶。尽管有研究证实RGD修饰的脂质体可以主动靶向到整合素高αvβ3表达的肿瘤细胞中［10］，但其与肿瘤细胞之间具有受体饱和效应。最新研究表明，二硫键修饰的环肽RGD（cRGD）与线性RGD相比，对整合素αvβ3具有更高的亲和力，所以构建cRGD修饰的给药系统可以更好的主动靶向于肿瘤细胞［11］。

基于上述情况，本研究构建了cRGD修饰的脂质体，该脂质体粒径在110 nm左右，且具有较高的血清稳定性，说明将构建的脂质体cRGD-LP应用在体内研究中时，cRGD-LP在体内循环中可以保持较高的稳定性，可以减少与血浆蛋白的结合，从而有更多的cRGD-LP蓄积在肿瘤部位，可以使得化疗效果增加的可能性大大提高。由于A549细胞高表达整合素受体αvβ3，而cRGD可以与αvβ3高度结合，因此，从流式细胞仪检测和激光共聚焦显微镜观察结果来看，A549细胞对cRGD-LP的摄取能力更高。正是由于cRGD可以与αvβ3高度结合，从A549肿瘤球穿透试验表明，cRGD-LP的肿瘤球穿透能力高于PEG-LP，且可以穿透至肿瘤球深部。细胞摄取和肿瘤球穿透试验均说明cRGD修饰的脂质体可以更好的与A549细胞结合，进入细胞发挥作用。如果将所构建的cRGD-LP载入化疗药物，应用到肺癌治疗时，会有更多的化疗药物靶向分布到肿瘤病灶中，从而使得化疗的疗效大大提高。因此，cRGD-LP展示出其将来在肺癌治疗中的良好的前景。

综上所述，cRGD修饰的脂质体给药系统，不仅有较高的稳定性，而且与PEG修饰的脂质体相比，更容易被A549细胞摄取，说明cRGD修饰的脂质体有潜力应用在肺癌的治疗中，为进一步针对肺癌的化疗研究奠定了基础。

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Study on liposomes modified by cRGD targeting to lung cancer cell A549 in vitro

Zhang Zhiqiang1，Ma Haiying2，Li Yunxia1，Yang Yanrong1，Zhao Xin11.Department of Respiration；2.Department of Cardiovascular Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan，453100，China

ObjectiveTo construct a research on liposomes modified by cRGD（cRGD-LP）and its targeting ability to A549 cells in vitro.MethodsThe cRGD-LP was prepared by film-ultrasonic method.The size and zeta potential of cRGD-LP were detected.The cellular uptake of cRGD-LP to A549 cells was evaluated by flow cytometry.The penetration ability of cRGD-LP into the tumor spheroid was inspected by laser confocal microscopy.ResultsThe size of cRGD-LP was around（112.3±7.8）nm；the polydispersity index（PDI）of cRGD-LP was 0.023±0.045；the zeta potential was（2.38±0.87）mV.The cRGD-LP was stable within 24 h and kept the particle diameter at the level of 115 nm.The cellular uptake ability of A549 to cRGD-LP was 1.7-fold as PEG-LP（liposomes modified by PEG）.The tumor spheroid penetration ability of cRGD-LP was higher than that of PEG-LP.ConclusioncRGD-LP has high tumor targeting ability to A549 cells，and it is a potential drug delivery system.

lung cancer；integrin；cRGD；liposomes

R 734.2

A

1004-0188（2016）05-0482-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.007

2015-05-28）

453100河南新乡，新乡医学院第一附属医院呼吸科（张志强，李运霞，杨艳荣，赵欣），心外科（马海英）