他汀类药物对心肌缺血再灌注心肌细胞Bax和Bcl-2表达的调控

2016-11-24姚新亮闫成芸鲁雪丽万琪琳

中国老年学杂志 2016年19期

关键词：阿托类药物免疫组化

姚新亮闫成芸张韩鲁雪丽万琪琳

(河南大学淮河医院心内科，河南开封 475000)

他汀类药物对心肌缺血再灌注心肌细胞Bax和Bcl-2表达的调控

姚新亮闫成芸张韩鲁雪丽万琪琳

(河南大学淮河医院心内科，河南开封 475000)

目的探讨他汀类药物对心肌缺血再灌注心肌细胞基因Bax和Bcl-2的调控作用。方法选取30只清洁级SD大鼠为研究对象，将该组大鼠用计算机软件编制的随机分配表随机分为三组，假手术组、缺血再灌注组、缺血性再灌注组+阿托伐他汀干预组，每组10只。假手术组每日给予2 ml的0.9%的氯化钠溶液；治疗组每日给予2 ml的0.9%的氯化钠溶液；干预组为缺血性再灌注组+阿托伐他汀干预组每日给予阿托伐他汀。以上大鼠灌胃3d后制作心肌缺血再灌注模型，模型成功后处死。采用免疫组化测定Bcl-2和Bax蛋白的表达、TUNEL法测定心肌细胞凋亡、RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达情况。结果治疗组和干预组大鼠的心肌细胞均呈现不同程度的心肌细胞凋亡现象，AI明显升高，均高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。但干预组大鼠的心肌凋亡指数AI低于治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组和干预组的Bcl-2和Bax mRNA的表达以及相关蛋白的表达显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。但干预组的Bcl-2 mRNA的表达以及相关蛋白的表达显著高于治疗组，Bax mRNA及相关蛋白的表达显著低于治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论他汀类药物对心肌缺血再灌注的心肌细胞具有保护作用，其作用机制可能与上调Bcl-2的水平和下调Bax的水平有关。

他汀类药物；心肌缺血再灌注；心肌细胞；Bax；Bcl-2

心肌缺血再灌注损伤是冠状动脉搭桥术、冠状动脉溶栓术以及介入治疗中常见的严重并发症，对患者的预后有较大影响〔1〕。他汀类药物是临床常用的降脂药物，此外，还具有免疫调节和影响细胞凋亡的作用；而且阿托伐他汀在心血管保护方面也具有明显效果〔2〕。但目前，他汀类药物抵抗心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的具体机制尚不完全清楚。本研究通过观察他汀类药物对心肌缺血再灌注心肌细胞Bax和Bcl-2表达的调控作用，分析他汀类药物对心肌细胞的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠，30只，清洁级，体重(250±20)g，由河南大学实验动物中心提供，医学实验动物环境设施，昼夜明暗交替时间：12 h/12 h。饲料喂养，饮水为自来水瓶装后高压灭菌。动物自由采食和饮水；每周换两次经高压灭菌的松木刨花垫料。饲养室内每周用0.5%新洁尔灭水溶液喷雾消毒1次。随机分为假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+阿托伐他汀干预组，每组10只。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂阿托伐他汀购自辉瑞制药有限公司，Bax、Bcl-2鼠抗人单克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自美国Santa公司。原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；10%中性甲醛；链霉亲和素-生物末复合物(SABC)免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、Fast EvaGreen®qPCR Master Mix购自美国Roche公司；2×PCR Mix 购自西安润德生物技术有限公司产品。Trizol、dNTPs (10 mmol/L)、随机引物(25 pmol/μl)、逆转录酶、Taq 酶、双氧水(ddH2O)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2.2 相关仪器浙江金华益迪医疗设备厂，轮转式石蜡切片机；黄石市恒丰医疗器械有限公司，恒温培养箱；麦克奥迪，BA400光学显微镜；成都泰盟科技有限公司，HX-300动物人工呼吸机等。

1.3 模型的制备假手术组每日给予2 ml 0.9%氯化钠溶液；缺血再灌注组，每日给予2 ml 0.9%氯化钠溶液；缺血再灌注+阿托伐他汀干预组每日给予阿托伐他汀(40 mg溶解于10 ml 0.9%NaCl溶液中，灌药剂量为体重(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g)，以上大鼠均灌喂3 d后制作大鼠心肌缺血再灌注模型。制备方法：将大鼠水合氯醛腹腔麻醉(10 ml/kg)，仰卧位固定于手术台上，接心电监护仪监测心电变化，用针形电极插入大鼠四肢皮下记录Ⅱ导联心电图。颈部正中切口，气管插管，接人工呼吸机(频率55次/min，潮气量1.5 ml/100 g，自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，于冠状动脉左前降支起始0.2 cm处穿线(以0号线结扎左冠状动脉前降支)。待呼吸、血压平稳15 min后，在结扎线与血管之间穿一直径2 mm、长5 mm的硅胶管。30 min后剪断丝线使血流再通，取出硅胶管。灌注120 min(假手术组仅穿线不结扎)，同步观察肢体导联心电图、颈动脉血压。之后处死动物，取出心脏。结扎成功标志：结扎线远端左心室前壁心肌颜色发绀，同步心电图Ⅱ导联表现为ST段抬高或R波高耸。制模成功标志：松开结扎线以恢复冠状动脉血量，左心室前壁由发绀逐渐红润，抬高的ST段下降二分之一〔3〕。

1.4 相关检测指标及方法

1.4.1 免疫组化测定Bcl-2和Bax蛋白的表达将剪下的缺血区心肌经4%甲醛固定48 h后(pH7.4)，将组织修块，采用石蜡包埋，标本经4 μm连续切片，室温放置30 min后，切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，消除内源性过氧化物酶的活性。一部分用于TUNEL法检测凋亡细胞；一部分用于免疫组化染色；一部分用于免疫组化检测Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。严格按照试剂盒的操作说明进行。用已知心脏组织阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化的结果判定：光学显微镜下观察，随机选择10个具有代表意义的高倍视野，每个视野计数 100 个细胞的阳性表达细胞数，判断表达程度。Bax定位于细胞质内，Bcl-2定位于细胞质或细胞核。阳性细胞染色呈棕黄色或棕褐色。免疫阳性率=免疫细胞阳性数/(免疫细胞阳性数+免疫细胞阴性数)×100%。

1.4.2 RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测，按照RNA fast200说明书进行实验操作。首先采用Total RNA提取液提取总RNA，按照TAKARA试剂盒将总 RNA逆转成cDNA并保存于-20℃冰箱，采用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，主要步骤有匀浆、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA浓度测定，然后制备反应液，按 Fermentas 逆转录试剂盒说明书逆转录反应、Real-Time PCR反应(共35个循环)，PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴乙啶)电泳分离，以β-actin作为内参照，反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线和熔解曲线，制作标准曲线。用ABI7500 FAST型荧光定量PCR仪检测，实验重复3次。PCR引物序列采用primer express2.0软件严格按照相关原则设计。

1.4.3 心肌细胞凋亡的检测将制备好的组织切片采用TUNEL试剂盒说明书进行标记染色，光学显微镜下观察。凋亡细胞质呈棕黄色，正常细胞质呈蓝色。高倍镜下每张切片随机选取10个视野，分别计算每个视野的凋亡细胞核细胞总数，凋亡指数(AI)=视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数×100%，将以上10个视野的AI取平均值。

1.5 统计学方法应用SPSS15.0软件，计数资料多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达心肌缺血再灌注组和阿托伐他汀组的Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达显著高于假手术组(P<0.05)。但阿托伐他汀组的Bcl-2 蛋白及mRNAGE DP 显著高于缺血再灌注组，Bax蛋白及mNRA表达显著低于缺血再灌注组(P<0.05)。见表1。

表1 三组大鼠Bcl-2和Bax 蛋白表达比较

与假手术组相比:1)P<0.05；与缺血再灌注组相比:2)P<0.05；下表同

2.2 心肌细胞凋亡的检测情况缺血再灌注组和阿托伐他汀组大鼠的心肌细胞均呈现不同程度的心肌细胞凋亡现象，AI明显升高〔(34.87±2.39)%、(20.82±1.95)%〕，均高于假手术组〔(4.39±1.84)%〕(P<0.05)。但阿托伐他汀组大鼠的心肌AI低于缺血再灌注组(P<0.05)。高倍镜下观察心肌缺血再灌注后凋亡细胞数明显增加(棕色)，缺血再灌注组显现大量的凋亡细胞，阿托伐他汀组较缺血再灌组凋亡细胞数明显下降，仅见少数散在的凋亡细胞。见图1。

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡情况

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是指缺血的心肌组织恢复血供时，导致再灌注区心肌细胞及局部血管网显著的病理生理变化〔4〕。心肌缺血再灌注不仅能够导致细胞坏死，还能诱导细胞凋亡。心肌细胞凋亡是引起心室重塑、心律失常以及心功能不全的重要原因。因此，减少心肌细胞凋亡有助于改善心肌缺血再灌注损伤的预后。近年来，有研究发现采用药物预处理能够有效抑制心肌缺血再灌注的心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积〔5〕。孟红等〔6〕报道，短期的阿托伐他汀能够清除缺血再灌注损伤大鼠的自由基，干预Fas蛋白表达，减少心肌细胞凋亡。孙晓靖等〔7〕研究显示，阿托伐他汀能够减轻急性损伤大鼠的心肌细胞凋亡，改善左室重塑，机制与促进Bax/Bcl-2趋于平衡有关。

本研究提示阿托伐他汀有抑制心肌细胞凋亡的作用，与上述学者的研究结果基本一致。心肌缺血再灌注损伤受众多因素的影响，其中一个重要的作用机制就是细胞凋亡。细胞凋亡受到细胞内促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的调控，当两种蛋白比例失衡时容易引发细胞凋亡〔8〕。Bcl-2蛋白发挥抑制细胞凋亡的作用，Bax表达水平增高时促进细胞凋亡，细胞内Bax/Bcl-2比值决定细胞是生存还是凋亡。本研究结果显示，心肌缺血再灌注大鼠，Bax/Bcl-2比值上升，因此表现为细胞凋亡明显增多。

通过药物干预凋亡相关基因的表达，调控细胞内信号传导途径，以减少细胞凋亡，可能会成为治疗心血管疾病的重要途径〔9〕。经过阿托伐他汀干预后，对抗细胞凋亡的机制可能与上调Bcl-2水平和下调Bax水平有关。高凤敏等〔10〕研究显示，阿托伐他汀预处理能够抑制缺血再灌注大鼠的脂质过氧化损伤，增强抗氧化酶的活性，减少心肌细胞凋亡，认为这种心肌保护作用与抑制了半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-3和Caspases-8蛋白的表达、提高NF-κB表达有关。由此可见，阿托伐他汀对抗心肌凋亡的机制是多方面的，在下一步的实验中笔者还将展开更深入的研究。

1 关键，孙妍，孙筱璐，等.阿托伐他汀对小鼠病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响研究〔J〕.中国循环杂志，2011；26(3)：220-3.

2 高宇囡，杨茂，陈延军，等.阿托伐他汀序贯治疗对行急诊PCI的急性心梗患者心功能的影响〔J〕.哈尔滨医科大学学报，2012；46(4)：360-3.

3 陈盼，赵明，蒋鹏，等.盐酸右美托咪定预处理对缺血-再灌注损伤大鼠心肌Bax和Bcl-2表达的影响〔J〕.重庆医学，2012；41(16)：1604-7.

4 周炜，陈玲，周逸，等.阿托伐他汀下调大鼠心肌梗死后线粒体融合素2表达和细胞凋亡〔J〕.基础医学与临床，2014；34(2)：168-71.

5 史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响〔J〕.中国药理学通报，2011；27(5)：666-70.

6 孟红，张英杰.阿托伐他汀对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响〔J〕.中国全科医学，2009；12(6)：465-8.

7 孙晓靖，陈玉岚，张向阳，等.普伐他汀与阿托伐他汀对急性损伤大鼠心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国全科医学，2013；16(21)：2470-2.

8 王素云，王海芸，黄晓燕，等.阿托伐他汀对大鼠缺血心肌TRAIL表达及细胞凋亡的影响〔J〕.温州医学院学报，2012；42(4)：317-21.

9 高玉峰，王小杰，闫文翠，等.生黄合剂对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡相关基因Bax，Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012；18(13)：244-7.

10 高凤敏，安锦丹，郭继芳，等.阿托伐他汀预处理对大鼠缺血-再灌注心肌氧自由基和凋亡的影响〔J〕.中国急救医学，2013；33(5)：465-7.

〔2015-12-19修回〕

(编辑袁左鸣)