参芪补肺汤对慢阻肺大鼠气道平滑肌细胞中相关因子的影响

吴桂英 张 葵 张湘燕 闫 萍 杨 柱

(贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002)



参芪补肺汤对慢阻肺大鼠气道平滑肌细胞中相关因子的影响

吴桂英 张 葵 张湘燕 闫 萍 杨 柱1

(贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨参芪补肺汤对慢阻肺(COPD)大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖中组蛋白去乙酰基酶2(HADC2)、乙酰化组蛋白H4表达的影响。方法 将SD大鼠随机分为正常组和COPD模型组。原代培养大鼠ASMCs取4～6代细胞，分为空白组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组和氨茶碱组。其中空白组为正常培养ASMCs，不予处理。模型组、中药低、高剂量组和氨茶碱组为COPD模型组培养ASMCs，模型组加入香烟提取物(CSE)及正常组大鼠血清；中药低剂量组加入CSE及中药低剂量组大鼠血清；中药高剂量组加入CSE及中药高剂量组大鼠血清；氨茶碱组加入CSE及氨茶碱。细胞免疫组织化学检测大鼠ASMCs增殖细胞核抗原(PCNA)及各组ASMCs中HDAC2、H4蛋白的表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠ASMCs明显增殖，ASMCs中的HDAC2表达明显降低，乙酰化组蛋白H4表达明显增高(P<0.05)。与模型组比较，中药低剂量组ASMCs增殖和HDAC2、乙酰化组蛋白H4表达无统计学差异(P>0.05)；中药高剂量组ASMCs平滑肌细胞增殖明显下降，ASMCs中的HDAC2表达明显增高，乙酰化组蛋白H4的表达明显降低(P<0.05)；氨茶碱组ASMCs增殖降低、ASMCs中的HDAC2表达明显增高(P<0.05)，乙酰化组蛋白H4表达无统计学差异(P>0.05)。结论 参芪补肺汤可抑制ASMCs增殖，其机制可能通过提高ASMCs中HDAC2的表达、抑制组蛋白H4的表达，影响其平衡状态发挥作用。

参芪补肺汤；慢性阻塞性肺疾病；气道平滑肌细胞；组蛋白去乙酰基酶2；乙酰化组蛋白H4

以益气补肺活血化痰法组方的参芪补肺汤能明显改善慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期肺气虚证患者症状，稳定肺功能，阻止肺功能下降〔1〕,抑制气道平滑肌增殖，但其机制不清楚。研究证实组蛋白去乙酰基酶(HDAC)2和乙酰化组蛋白H4参与COPD 支气管平滑肌增殖〔2〕。本实验通过体外培养气道平滑肌细胞(ASMCs)，观察参芪补肺汤对COPD大鼠ASMCs增殖及对ASMCs中HDAC2、H4表达的影响，从细胞水平探讨参芪补肺汤抑制气道平滑肌增殖机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 清洁级SD大鼠由重庆第三军医大学动物中心购置；脂多糖、噻唑蓝(MTT)试剂盒为美国Sigma公司；HDAC2抗体、核转录因子(NF)-κBp65抗体为美国RD公司；兔抗肌动蛋白(α-actin)抗体为英国Abcam公司。注射用氨茶碱，常州兰陵制药有限公司，批号：0911022，参芪补肺汤(黄芪30 g、党参15 g、补骨脂15 g、丹参30 g、百部15 g、桑白皮10 g)贵阳中医学院第一附属医院购置,水煎2次,浓缩为含生药2 g/ml的药液。雄狮牌香烟(焦油量：13 mg，烟气烟碱量：1.2 mg，烟气一氧化碳量：13 mg)，杭州利群卷烟厂。

1.2 含药血清制备 选取(200±20)g的SD大鼠15只，随机分为中药高剂量组、中药低剂量组和正常组，每组5只。中药高、低剂量组分别给予参芪补肺汤水煎剂灌胃，剂量分别为每天5.04 g/100(相当于成人常规临床用量的4倍)、1.26 g/100 g(相当于成人常规临床用量等效用量)，正常组予生理盐水灌胃1 ml/100 g。每日2次，连续5 d，末次给药后2 h，腹主动脉取血，分离血清，并用0.45 μm滤膜过滤，56℃水浴灭活30 min，-20℃保存备用。含药血清的使用终浓度为5%。

1.3 香烟提取物(CSE)制备 使用前30 min准备，将香烟点燃后，其过滤嘴一端连接橡皮管，橡皮管的另一端连接洗耳球。洗耳球根据操作方式，提前测量平均容量。准备一只空的密闭瓶，含有10 ml DMEM培养基，吸取约300 ml的烟雾注入瓶中，摇匀，使烟雾融入DMEM中，即为原液〔3〕。

1.4 肺气虚证COPD大鼠模型的建立 参照文献〔4〕复制COPD肺气虚证大鼠模型，方法：将脂多糖配制成1 mg/ml的溶液，4℃保存。造模开始第1、14天注射配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入气道内，第2天至13天、第15天至第28天，每日将大鼠放在大约60 cm*40 cm*50 cm的储物箱中内被动吸烟，每次每笼大鼠1 h，5只大鼠/笼，2次/d，每次间隔4 h。大鼠被动吸烟的方法为将点燃的雄狮牌香烟放在鼠笼架上，让大鼠被动吸烟。肺气虚证COPD模型大鼠造模共28 d。

1.5 大鼠ASMCs的分离、培养及鉴定 肺气虚证COPD大鼠模型造模成功后，随机挑选模型大鼠以及正常生长未做处理的大鼠，麻醉后将大鼠放血处死，钝性分离出气管，用手术剪分离出大鼠完整的心肺组织。将心肺组织置入4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)液中，迅速放到无菌操作台上，再用含有100 U/ml的青、链霉素的PBS液漂洗3次，分离出气管分叉以下的支气管，眼科剪剪去外膜，用刀片刮去内膜，获得较干净的支气管平滑肌块。将分离的组织块剪成组织小块，并贴在培养孔板面上，37℃培养箱放置2 h后添加500 μl DMEM高糖+20%胎牛血清(FBS)的培养基，4 h后再添加培养基至2 ml/孔。待组织块周围溢出细胞长满后进行传代，并做细胞纯化处理，选用4～6代的细胞。培养的原代气道平滑肌细胞经免疫组织化学法鉴定平滑肌细胞特有的α-肌动蛋白〔5〕。

1.6 分组及干预 原代培养的ASMCs分为空白组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组和氨茶碱组。其中空白组为正常大鼠气道平滑肌培养出的ASMCs，不予处理。另外四组为肺气虚证COPD模型大鼠的气道平滑肌培养出的ASMCs。模型组：加入CSE及正常组血清。中药低剂量组：加入CSE及中药低剂量组血清。中药高剂量组：加入CSE及中药高剂量组血清。氨茶碱组：加入CSE及10 μmol/L氨茶碱，各组干预处理后24 h进行相关指标检测。

1.7 平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)测定ASMCs增殖 24 h干预处理后的各组细胞经无水乙醇固定细胞，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)检测PCNA蛋白表达。空白组ASMCs用PBS代替一抗。PCNA阳性表达主要为ASMCs核呈棕黄色或者棕褐色。用IPP6.0分析软件测出平均光密度值。

1.8 免疫组化检测ASMCs中HDAC2和H4蛋白表达 爬片后细胞进行分组干预后，用无水乙醇固定细胞，采用SP检测HDAC2、H4蛋白表达。HDAC2、H4阳性表达主要为ASMCs细胞核为黄色、棕黄色或者棕褐色。用IPP6.0测出平均光密度值。

1.9 统计学方法 应用SPSS17.0软件，多组间差异显著性检验采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD法。

2 结 果

2.1 ASMCs细胞鉴定 显微镜下,经原代培养的ASMCs呈梭形,有较长的突起,圆形的细胞核位于细胞中央,呈疏密相间、典型“峰和谷”生长状态。免疫细胞化学染色可见ASMCs α-actin阳性表达，细胞质呈棕黄色，鉴定培养的细胞为ASMCs。

2.2 PCNA测定结果 与空白组(0.131 0±0.003 92)比较，模型组PCNA蛋白表达(0.194 0±0.012 36)明显升高(P<0.05)；与模型组比较，中药低剂量组PCNA蛋白表达(0.189 5±0.005 20)无统计学差异(P>0.05)，中药高剂量组(0.159 5±0.005 45)和氨茶碱组(0.162 3±0.005 38)PCNA蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图1。

2.3 免疫组化检测ASMCs中HDAC2、H4蛋白表达 与空白组比较，模型组HDAC2表达的颜色均明显变浅，H4蛋白表达的颜色明显加深。与模型组比较，中药低剂量组中HDAC2、H4蛋白表达颜色相近，中药高剂量组HDAC2蛋白表达颜色深于模型组，H4蛋白表达则浅于模型组。氨茶碱组HDAC2蛋白表达颜色深于模型组，H4蛋白表达与模型组无区别。见图2,表1。

图1 各组PCNA测定结果(倒置显微镜，×100)

图2 ASMCs中HDAC2、H4蛋白表达(DAB,×100)

表1 各组大鼠ASMCs中乙酰化组蛋白H4、HDAC2的蛋白表达

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

COPD的重要病理特征之一就是气道重构，慢性炎症反应导致气道壁损伤和修复反复发生，造成气道狭窄，导致气道壁结构重构，引起气道阻塞〔6〕。气道平滑肌细胞的增殖不仅使气道对刺激的收缩更强烈，加重气道高反应性，更重要的是能使气道壁增厚，从而使气道狭窄，发生不可逆的气流阻塞。

组蛋白乙酰化能促进细胞增殖〔7〕,组蛋白乙酰化程度主要受真核细胞内组蛋白乙酰化酶(HAT)和HDAC共同调控〔8〕。HDACs 可以抑制组蛋白的乙酰化，在核心组蛋白的过度乙酰化方面起着重要作用〔9〕。HATs 和HDACs 之间的平衡失调导致组蛋白非正常的乙酰化，使基因表达失控，从而导致细胞增殖，肿瘤的发生〔10〕。HAT/HDAC作用于组蛋白，可影响COPD气流阻塞程度及疾病预后〔11〕。

本实验提示HDAC2和乙酰化的组蛋白H4在ASMCs增殖中发挥重要作用。参芪补肺汤高剂量组能抑制COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖，同时，ASMCs中HDAC2蛋白质表达明显增高，乙酰化的组蛋白H4表达明显降低。氨茶碱组能抑制COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖，同时，ASMCs中HDAC2蛋白质表达明显增高，而乙酰化的组蛋白H4表达无明显降低。进一步说明中药抑制COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖效应，可能是通过调节组蛋白乙酰化和去乙酰化平衡，使组蛋白去乙酰化，HDAC2与乙酰化的组蛋白H4达到平衡状态，从而影响COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖。

综上所述，氨茶碱组能抑制COPD大鼠气道平滑肌细胞的增殖，但不完全是影响蛋白乙酰化和去乙酰化平衡达到的。通过本实验明确了中药抑制ASMCs增殖的部分机制，为临床用药提供了理论依据。

1 张 葵,张培琴,陈昱江,等.参芪补肺汤对慢性阻塞性肺疾病稳定期肺气虚证患者肺功能的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012;18(1):213-6.

2 吴桂英,张 葵,闫 萍,等.参芪补肺汤对慢性阻塞性肺疾病肺气虚证大鼠气道平滑肌中乙酰化组蛋白H4、HDAC2和NF-κB p65表达的影响〔J〕.中药新药与临床药理,2014;25(6):688-93.

3 陈宏斌,徐永健，谢俊刚,等.香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖中ERKs及NF-KB表达的影响〔J〕.华中科技大学学报：医学版,2007;36(4):544-7.

4 李泽庚,彭 波,张杰根,等.肺气虚证模型大鼠的建立〔J〕.北京中医,2005;24(1):53-5.

5 杨 诚,梁瑞韵,黄林洁,等.三种方法培养慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌细胞的比较〔J〕.中国组织工程研究,2012；16(50):9448-52.

6 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)〔J〕.中华结核与呼吸杂志,2013；36(4):255-64.

7 Adcock IM,Ford P,Ito K,etal.Epigenetics and airways disease〔J〕.Respir Res,2007;7:21.

8 李 霞，张玉军.组蛋白H4 的共价修饰在表观遗传调控中的作用研究进展〔J〕.山东医药,2013;53(15):91-3.

9 李梅华,钟小宁,文明智,等.红霉素对香烟烟雾刺激的人巨噬细胞组蛋白去乙酰化酶3 表达影响的实验研究〔J〕.中国免疫学杂志,2014;30(5):600-3.

10 Groselj B，Sharma NL，Hamdy FC，etal.Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers:effects on DNA damage signalling and repair 〔J〕.Br J Cancer，2013;108( 4):748-54.

11 窦丽阳,徐治波,冯玉麟,等.组蛋白乙酰转移酶/组蛋白去乙酰基酶在慢性阻塞性肺疾病发病机制和治疗中的研究进展〔J〕.国际呼吸杂志,2007;27(19):1463-6.

〔2015-12-30修回〕

(编辑 袁左鸣)

Effects of Shenqi Bufei Decoction on the expression of HDAC2 and histone acetylation H4 in airway smooth muscle cells proliferation of COPD rat model

WU Gui-Ying,ZHANG Kui,ZHANG Xiang-Yan,et al.

Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，Guizhou,China

Objective To observe the effects of Shenqi Bufei Decoction on the expression of HDAC2 and histone acetylation H4 in airway smooth muscle cells (ASMCs) proliferation of COPD rat model. Methods The 4～6 cells of cultured primary rat ASMCs were divided into blank,model,low,high dose Chinese medicine and aminophylline groups. ASMCs of the blank control group were normally cultured airway smooth muscle cells without treatment. ASMCs of the model group,low dose Chinese medicine group,high dose Chinese medicine group and aminophylline group respectively were the airway smooth muscle cells of the COPD rat. The model group was stimulated with cigarette smoke extract (CSE) and serum of the low,high dose Chinese medicine and aminophylline were added with low,high dose Chinese medicine and aminophylline respectively. The expression of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and histone deacetylase 2(HDAC2),acetyl histone H4 cell proliferation were tested by immunohistochemical staining.Results Compared with blank group,the airway smooth muscle cells proliferation and expression of cetyl histone H4 protein were significantly increased (P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly decreased of model group(P<0.05). Compared with the model group,there was not significant difference between low-dose Chinese medicine group and model group(P>0.05),the airway smooth muscle cells proliferation and expression of acetyl histone H4 protein were significantly decreased (P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly increased of the high dose Chinese medicine group (P<0.05),the airway smooth muscle cells proliferation was significantly decreased(P<0.05),the expression of HDAC2 protein was significantly increased(P<0.05) and expression of acetyl histone H4 protein was unchanged of the aminophylline group (P>0.05).Conclusions Shenqi Bufei decoction can restrain the proliferation of ASMCs of COPD by increasing the expression of HDAC2,inhibiting the expression of acetyl histone H4 in airway smooth muscle cell.

Shenqi Bufei Decoction;COPD; Airway smooth muscle cell; Histone deacetylase 2;Acetyl histone H4

国家自然科学基金资助项目(No.81160450)；贵州省科技计划项目〔黔科合SY字(2012)3142〕

1 贵阳中医学院

张 葵(1968-)，女，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事中西医结合防治老年病研究。

吴桂英(1958-)，女，副主任医师，主要从事中西医结合防治老年病研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)19-4696-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.010