针刺对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表达的影响

曹俊红

(河南省中医院妇产科，河南 郑州 450002)



针刺对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表达的影响

曹俊红

(河南省中医院妇产科，河南 郑州 450002)

目的 探讨针刺对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白、介导细胞凋亡蛋白(Fas)表达的影响及针刺治疗围绝经期综合征的作用机制。方法 从32只SD雌性大鼠中筛选出符合围绝经期特征的SD雌性大鼠24只，随机分为针刺组、药物组、围绝经期组，各8只，另选择8只5个月雌性SD大鼠作为青年大鼠组，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)、免疫组化法检测卵巢颗粒细胞的凋亡及Bcl-2、Fas表达，采用IMS细胞图像分析法对染色图像进行分析，对各组阳性染色面积均值进行统计分析，对比各组组间的差异。结果 与青年大鼠组相比，围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡、Bcl-2蛋白表达、Fas蛋白表达均具有极显著差异(P<0.01)；针刺治疗后大鼠体内卵巢颗粒细胞凋亡减少(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达提高(P<0.05)，Fas蛋白表达降低(P<0.05)，针刺组与药物组之间大鼠体内卵巢颗粒细胞凋亡、Bcl-2蛋白及Fas蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)。结论 针刺具有抑制围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡、增加Bcl-2蛋白表达及降低Fas蛋白表达的作用。

针刺；围绝经期；颗粒细胞；B淋巴细胞瘤-2基因；介导细胞凋亡蛋白

围绝经期又称女性更年期，是女性生殖功能由旺盛走向衰退的阶段。在此期间，女性身体内卵泡加剧闭锁、数量减少，导致雌性激素分泌不足，卵巢逐渐停卵并走向功能衰竭〔1〕。现代研究表明，卵泡闭锁与细胞的凋谢密不可分，其中颗粒细胞的大量凋亡直接诱使卵泡闭锁急剧化，雌性激素分泌减少，雌二醇水平降低〔2〕。本研究采用针刺疗法干预大鼠体内颗粒细胞的凋亡，为针刺治疗围绝经期综合征的作用机制研究提供方向。

1 材料与方法

1.1 动物 选取11～14个月SD雌性大鼠32只，体重(380±20)g；5个月SD雌性大鼠8只，体重(300±20)g，均由上海中医药大学实验动物中心提供(质量合格证号：沪医动证字05号)。

1.2 仪器与试剂 毫针(直径0.22 mm，长13 mm，购于苏州华佗医疗器械有限公司)，石蜡切片机(型号HAQ-78J，北京科誉兴业科技发展有限公司)，万能显微镜(型号LR66238，OPTON)，摄像机(型号HC-X920MGK-K，Panasonic)，电热恒温水温箱(型号HH.W21.600S，上海跃进医疗器械厂)，电子天平(型号UTP313，上海花潮电器有限公司)；IMS医用图像分析系统；更年安片(华润三九药业有限公司)，Envision免疫组化试剂，Bcl-2，Fas抗体(美国Santacruz公司)，其他试剂均由实验室提供。

1.3 方法

1.3.1 围绝经期大鼠模型的确立 参照文献〔3〕，对雌性SD大鼠进行阴道组织采样，并于显微镜下观察HE染色后组织学变化，连续15 d，动情周期呈无规律变化的大鼠确立为围绝经期大鼠模型。

1.3.2 分组处理 根据阴道组织采样法，从32只雌性大鼠中筛选出符合围绝经期特征的雌性大鼠24只，随机分为针刺组、药物组、围绝经期组，每组8只。针刺组：参照《实验针灸学》相关方法，对大鼠“肾俞”、“足三里”及“三阴交”进行针刺处理，进针深度分别为0.5 cm、0.3 cm、0.3 cm，小幅捻转后，留针20 min，1次/d，治疗15次〔4〕。药物组：参照人与动物药用计量换算方法，将更年安片制成浓度为12%的混悬液，对大鼠进行灌胃处理，1次/d，治疗15次。5个月雌性SD大鼠作为青年大鼠组，与围绝经期组均只进行抓取刺激，1次/d，持续15次〔5〕。

1.3.3 样本采集 治疗结束后，断头处死所有大鼠，迅速取出右侧卵巢，10%甲醛固定后，石蜡包埋切片，备用。

1.3.4 指标检测方法 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)、免疫组化法卵巢颗粒细胞凋亡和B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、介导细胞凋亡蛋白(Fas)表达。

1.3.5 评定标准 以切片中卵巢颗粒细胞染色的深浅程度作为判定依据，对各组卵巢颗粒细胞进行比较；以被染色卵巢颗粒细胞染色面积作为指标，采用IMS细胞图像分析法对其均值进行统计分析。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件计量资料组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用LSD法，方差不齐者用Games-Howell法检验，等级资料采用Ridit检验。

2 结 果

2.1 卵巢颗粒细胞凋亡的检测结果 围绝经期大鼠体内卵巢颗粒细胞颜色普遍较深，多呈棕褐色；针刺组和药物组次之，多呈棕色或浅棕色；青年大鼠组颜色最浅。在卵巢颗粒细胞凋亡对比中，围绝经期组与青年大鼠组有极显著性差异(P<0.01)，围绝经期与针刺组具有显著性差异(P<0.05)，药物组与绝围经期组、药物组与针刺组均无显著差异(P>0.05)。见图1，表1。

2.2 卵巢颗粒细胞中Bcl-2蛋白表达检测结果 图2可见，围绝经期大鼠体内卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白染色普遍较浅；针刺组与药物组颜色较深，呈浅棕色、棕黄色；青年大鼠组颜色最深，多呈棕褐色。在卵巢颗粒细胞中Bcl-2蛋白表达对比中，围绝经期组与青年大鼠组具有极显著性差异(P<0.01)，围绝经期与针刺组、药物组具有显著性差异(P<0.05)，针刺组与药物组无显著性差异(P>0.05)，见表1。表明围绝经期大鼠体内卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达低于青年大鼠组，针刺和药物可提高卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达，两者治疗效果差别不明显。见图2。

图1 卵巢颗粒细胞(TUNEL染色，×400)

图2 卵巢颗粒细胞Bcl-2表达(免疫组化染色，×400)

2.3 卵巢颗粒细胞Fas蛋白表达检测结果 围绝经期大鼠体内卵巢颗粒细胞Fas蛋白染色较深，针刺组与药物组颜色次之，多呈先棕色或浅棕色 青年大鼠组最深，呈褐色或棕褐色。围绝经期组与青年大鼠组、针刺组、药物组均具有极显著性差异(P<0.01)，针刺组与药物组无显著性差异(P>0.05)，见表1，图3。

表1 各组卵巢颗粒细胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表达结果

与围绝经期组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

图3 卵巢颗粒细胞Fas表达(免疫组化染色，×400)

3 讨 论

围绝经期是女性绝经前一段时间，多伴随着月经紊乱、抑郁、烦躁、失眠、潮热、盗汗、骨质疏松等症状，随着现代社会生活压力增大，围绝经期综合征已经成为影响患者的身心健康和家庭和睦的一个主要因素，成为医学界亟待解决的重大疾患之一〔6〕。中医根据对围绝经期综合征的辨证论治，认为肾虚该病之本〔7〕；临床实践发现中药及体针治疗对更年期综合征均具有较好的治疗效果，其中针刺疗效高，副作用小，易于操作，易于患者接受，具有广阔的发展前景〔8〕。

近年来，有学者分别从器官、基因等方面对围绝经期综合征进行了实验研究〔9〕，发现绝经前，女性卵巢内颗粒细胞不断的增殖与分化，为卵泡细胞的发育、成熟提供有利环境，成熟卵泡的数量维持在生殖需要的正常范围内，卵巢功能正常运行。进入围绝经期，卵巢内颗粒细胞不断凋亡，导致卵泡发生强烈闭锁，无法回到正常发育轨道，数量也急剧减少，患者体内雌激素、孕激素水平降低，卵巢功能缓慢走向衰竭。因此，卵巢颗粒细胞的凋亡与卵巢的衰退具有密不可分的联系。而卵巢颗粒细胞的凋亡是由多基因共同参与调控的结果，如Bcl-2蛋白、Fas蛋白、P53等，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，颗粒细胞中Bcl-2蛋白的表达与卵泡的闭锁相关。本文结果发现围绝经期大鼠卵巢内颗粒细胞凋亡和Fas蛋白表达均明显高于青年大鼠组，Bcl-2蛋白表达显著低于青年大鼠，针刺和药物治疗都具有抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，提高卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达，抑制Fas蛋白的表达的作用，提高体内雌性激素水平，其中针刺治疗组效果要略优于药物治疗组，但结果不具有显著性差异。根据实验结果分析，针刺治疗围绝经期综合征可能是通过抑制卵巢颗粒细胞凋亡，调节Bcl-2基因、Fas基因的表达，减缓卵泡的闭锁性衰退过程，增加了体内卵泡发育成熟的几率，使得患者体内雌性激素水平提高而发挥治疗效果。

1 Jarzgzabek-Bielecka G，Wilczak M，Potasińska-Sobkowska A，etal.Overweight，obesity and female sexuality in perimenopause：a preliminary report〔J〕.Prz Menopauzalny，2015；14(2)：97-104.

2 Frye JB，Lukefahr AL，Wright LE，etal.Modeling perimenopause in Sprague-Dawley rats by chemical manipulation of the transition to ovarian failure〔J〕.Comp Med，2012；62(3)：193-202.

3 Shengqiang L，Wenna L，Yachan L，etal.Effect of Chaihushugan San on expression of the Raf/mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway in the hippocampi of perimenopausal rats induced by immobilization stress〔J〕.J Tradit Chin Med，2015；35(4)：445-52.

4 余光曙.实验针灸学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2012：75-82.

5 张大方，金若敏.药理与中药药理实验〔M〕.上海：上海科学技术出社，2008：6.

6 郝 晶，李淑杏，陈长香，等.社区女性围绝经期综合征的危险因素〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(9)：2534-5.

7 冒湘琳，张丽娟，陆黎黎，等.卵巢早衰的中医辨证论治〔J〕.中国实验方剂学杂志，2014；20(21)：240-2.

8 金春兰，木村通郎，平尾幸久，等.针刺对超排卵小鼠卵巢反应及卵巢组织FSH-R表达的影响〔J〕.北京中医药，2012；31(8)：620-3.

9 Zhang K，Zeitlian G，Adel G，etal.Enhanced hypothalamic-pituitary sensitivity to estrogen in premenopausal women with diminished ovarian reserve compared with older perimenopausal controls〔J〕.Menopause，2011；18(8)：880-5.

〔2015-11-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

曹俊红(1973-)，女，硕士，主治医师，主要从事中西医妇产科方面的研究。

R71

A

1005-9202(2016)19-4714-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.019