桑叶黄酮和多糖对糖尿病大鼠血清肿瘤坏死因子-α、C反应蛋白含量及肾功能的影响

黄立佳 杜月光 孙梽均 周宏明 吕 勃 沈晨璐 鲍徐敏

(浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053)



桑叶黄酮和多糖对糖尿病大鼠血清肿瘤坏死因子-α、C反应蛋白含量及肾功能的影响

黄立佳 杜月光1孙梽均 周宏明 吕 勃 沈晨璐2鲍徐敏

(浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310053)

目的 研究桑叶黄酮和多糖对糖尿病(DM)大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α和C反应蛋白(CRP)含量及肾功能的影响。方法 SD大鼠用高脂高糖饲料加小剂量链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。将SD大鼠随机分为正常组、模型组、桑叶黄酮治疗组、桑叶多糖治疗组。检测血糖、血尿素氮、血肌酐、检测24 h尿蛋白定量、计算肾指数；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清中的CRP和TNF-α的含量。结果 ①模型组大鼠血糖、肾指数、24 h尿蛋白定量、血尿素氮和血肌酐与正常组大鼠比较均明显升高(P<0.01)，而桑叶黄酮治疗组和桑叶多糖治疗组明显低于模型组(P<0.01)。②模型组大鼠血清中CRP和TNF-α的含量明显高于正常组(P<0.01),而桑叶黄酮治疗组和桑叶多糖治疗组低于模型组(P<0.05或P<0.01)。③桑叶黄酮和桑叶多糖可减轻肾脏病理变化。结论 桑叶黄酮和多糖可能通过下调糖尿病大鼠血清中TNF-α和CRP的含量，改善炎症反应，从而对肾脏起到保护作用。

糖尿病肾病；桑叶黄酮；桑叶多糖；肿瘤坏死因子α；C反应蛋白

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并发症，也是终末期肾衰竭(ESRF)的主要原因。目前普遍认为糖脂代谢紊乱引起的免疫炎症反应在DN发生发展过程中发挥着重要作用。炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α及C反应蛋白(CRP)可引起局部炎症，导致血管内皮细胞功能障碍或直接损伤血管内皮细胞等，与DN的发生发展密切相关。研究发现桑叶黄酮(MLF)和桑叶多糖(MLP)具有降血糖、抗炎症的功能〔1～4〕，但对其是否可防治DN的相关研究尚甚少，本研究旨在通过观察CRP和TNF-α在DN大鼠血液中的含量，研究桑叶黄酮和多糖对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及从炎症角度探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、饲养条件和饲料 32只健康SPF级雄性SD大鼠，体重(220±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。饲养条件：清洁级实验饲养室，温度(23±2)℃，湿度50%～70%,分笼饲养，自由摄水饮食，自然昼夜光线照明。高脂饲料配方：胆固醇1%，胆盐0.1%，猪油10%，蛋黄粉5%，全脂奶粉5%,普通饲料78.9%。

1.2 药物与试剂 MLP和MLF(购于南京泽朗医药科技有限公司，MLP批号：ZL130915268，MLP批号：ZL131023596)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，CRP和TNF-α检测试剂盒(杭州诚维生物科技有限公司)。

1.3 主要仪器 罗氏卓越型血糖仪及试纸；日立7020全自动生化分析仪；Thermo牌Varioskan Flash型酶标仪；Motic牌BA210型光学显微镜。

1.4 方法

1.4.1 动物模型复制 将大鼠适应性喂养1 w后，禁食16～18 h。将STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.5)，配成1%的溶液，按30 mg/kg单次尾静脉注射，注射当天开始给予高糖高脂饲料饲养。1个月后尾静脉取血测定血糖，随机血糖>16.7 mmol/L，持续3 d，确定为DM大鼠模型。

1.4.2 分组与给药 DM模型复制成功后，随机分为模型组，治疗组和MLP治疗组，每组各8只，同时设立正常组。正常组给予普通饲料喂养，模型组和治疗组继续给予高脂高糖饮食。治疗组根据以往经验，MLF治疗组给予MLP 40 mg/kg灌胃，MLP治疗组给予MLF 150 mg/kg灌胃；模型组和正常组给予3 ml蒸馏水灌胃，每日1次，连续8 w。

1.4.3 检测指标及方法 于给药8 w后，以20%乌拉坦1.5 g/kg腹腔内注射麻醉后，心脏抽血，处死大鼠。摘取肾脏，去除包膜，称重，作长轴方向对切。取部分肾脏固定于10%甲醛缓冲液中供病理检测。

1.4.3.1 一般情况观察 每日观察大鼠精神状态、活动状况、毛发及体重、排便情况。

1.4.3.2 生化指标检测 应用全自动生化分析仪测定空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及24 h尿蛋白定量(U-TP)等生化指标。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血液中CRP和TNF-α的含量，并分别记录。

1.4.3.3 肾脏组织病理观察与分析 肾组织经10%中性甲醛固定，脱水，再石蜡包埋与切片，行HE染色，光镜下观察肾脏组织形态学改变。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 一般情况观察 正常组大鼠精神状态良好，毛色白且致密，有光泽，反应灵敏，活动正常。模型组大鼠精神萎靡，行动迟缓，毛发杂乱、短竖、无光泽，表现为多饮、多食、多尿、消瘦。MLF治疗组和MLP治疗组大鼠精神状况较好，反应较灵敏，毛色可，体重较模型组大鼠有所增加，反应灵敏度较正常组差，但仍高于模型组。

2.2 各组大鼠生化标指检测 模型组GLU、BUN、Cr、肾指数、U-TP均高于正常组(P<0.01),与模型组比较，MLF治疗组和MLP治疗组的GLU、BUN、Cr、肾指数、U-TP均明显降低(P<0.01)。见表1。

2.3 各组大鼠血液TNF-α和CRP的含量 模型组血液TNF-α和CRP的含量明显高于正常组(P<0.01)，而MLF治疗组和MLP治疗组血液TNF-α和CRP的含量低于模型组(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.4 各组大鼠肾组织病理变化 光镜下HE染色可见正常组大鼠肾小球内毛细血管腔张开,系膜区基质均匀，肾小管结构正常。模型组可见肾小球体积增大，系膜细胞增多，基底膜增厚，系膜区基质增多,使血管腔变小,部分肾小管上皮细胞呈空泡变，间质可见有少量炎细胞浸润。治疗组以上病变有不同程度的减轻。

表1 各组生化指标、血液TNF-α和CRP的含量比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

3 讨 论

DN的病理基础是肾小球和肾小管间质细胞外基质(ECM)进行性积聚。研究证实〔5〕炎症因子在DN 发病机制中具有非常重要的作用，可通过多种机制促进肾小球肥大和巨噬细胞在肾组织中的浸润，刺激ECM合成并抑制其降解， 促进肾小球硬化和间质纤维化的发生，导致蛋白尿的发生及肾脏衰竭。

TNF-α是细胞因子网络的一个重要成员，可由体内多种细胞产生，可介导生长调节，炎症、免疫调节等多方面效应。在高血糖刺激下血流动力学改变、糖基化终末产物(AGEs)、代谢紊乱均可使肾脏局部释放TNF-α〔6〕。TNF-α通过以下机制引起DN的发生〔7,8〕：①诱导产生氧自由基引起氧化应激；②增加系膜细胞cAMP及cGMP的合成，促进系膜细胞合成前列腺素和血小板活化因子增多，促进血栓形成，使系膜细胞结构和形态发生改变；③提高系膜细胞单核细胞趋化因子(MCP)-1的表达和分泌，促进DN产生；④TNF-α可直接诱导细胞凋亡；⑤诱导细胞间黏附分子(ICAM)-1的表达；⑥刺激瘦素的分泌。

CRP是由肝脏合成的一种急性期反应蛋白，CRP不仅是炎症标志物，而且其本身直接参与炎症过程。正常时机体CRP含量甚微，当机体发生感染和炎症等时CRP急剧上升。近年研究发现体内高水平CRP与DM有关，并且可能是DN发生发展的一个危险因素。CRP引起DN的机制〔7,9～11〕包括：①引起局部炎症，导致血管内皮细胞功能障碍或直接损伤血管内皮细胞，导致微血管病变；②降低内皮型一氧化氮合酶的表达及生物学活性；③参与氧化应激，使低密度脂蛋白被氧化为氧化低密度脂蛋白，后者可增强单核细胞对血管内皮的黏附和浸润；④刺激血管内皮释放炎症因子ICAM-1,TNF-α及MCP-1等，促进白细胞释放超氧化物和蛋白水解酶，引起组织损伤；⑤激活机体凝血和补体系统，打破机体凝血和纤溶系统的平衡，引发血管病变，最终导致DN发生。本实验结果表明炎症反应可能参与了DN的发生发展。

桑叶是常用中草药之一，其中含有丰富的多糖和黄酮成分。近年来研究证实〔12〕，黄酮通过抗氧化机制清除自由基， 保持胰岛β 细胞的结构完整维持其正常生理功能， 从而降低DM患者血糖水平， 防止并发症的发生。MLP通过调节糖脂代谢，降低血糖、血脂和升高胰岛素水平，但其是否对DN具有保护作用及其机制尚未见报道。本研究发现MLP可降低血糖，抑制肾脏肥大、降低尿蛋白， 防止DN的发生发展，并且可降低血中TNF-α和CRP含量。DM时高血糖、氧化应激等因素诱导大量炎症介质释放，加重肾脏炎症反应，导致肾脏损伤。 由此我们推测，MLF和MLP对DN模型大鼠肾脏具有一定的保护作用，其保护机制可能与降低血糖水平及抗氧化作用，进而抑制炎症因子TNF-α和CRP等的分泌有关，但这还有待进一步研究。

1 潘剑用,汪志平,党江波，等.夏桑叶的体外抗氧化活性及其主要功能成分研究〔J〕.核农学报,2011；25(4):754-9,778.

2 李先佳,任丽平,于海英,等.桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞氧化损伤的影响〔J〕.医药导报,2013；32(6):701-4.

3 罗明琍,吴 薇,刘 伟，等.桑叶不同有效部位对2型糖尿病大鼠的降糖作用〔J〕.中国医院药学杂志,2013；33(15):1221-6.

4 任岩海,刘洪凤,韩智学.桑叶多糖对2型糖尿病大鼠血糖血脂的影响〔J〕.中医药学报,2013；41(1):20-1.

5 Shikata K,Makino H.Microinflammation in the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.J Diabetes Invest,2013；4(2):142-9.

6 井 源，韩 婷.肿瘤坏死因子-α在糖尿病肾损害中的作用与机制〔J〕.国外医学(老年医学分册),2009；30(2):78-80.

7 Mora C ,Navarro JF.The role of inflammation as a pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes 〔J〕.Curr Diab Rep，2005；5(6)：399-401.

8 Kuhad AL,Chopra K.Attenuation of diabetic nephropathy by tocotrienol:involvement of NF-κB signaling pathway〔J〕.Life Sci,2009；84(9-10):296-301.

9 Abrahamian H,Endler G,Exner M,etal.Association of low grade inflammtion with nephropathy in type 2 diabetic patient role of elevated CRP-levels and 2 different gene-polymorphisms of proinflammatory cytokines〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabet,2007；115(1) 38-41.

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12 薛淑萍,张立伟.桑叶总黄酮清除自由基作用研究〔J〕.山西师范大学学报(自然科学版),2009；23(4):66-8.

〔2015-05-01修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

浙江省新苗人才计划项目(No.2013R410009)

1 基础医学院 2 护理学院

杜月光(1968-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治的实验研究。

黄立佳(1992-)，男，主要从事临床医学研究。

R363

A

1005-9202(2016)19-4703-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.013