补中益气汤对A549/DDP与A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生长的影响

高 原 王 莹 陈 奇 井 欢 于 丹 潘 茜 王 哲 刘春英

(辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，辽宁 沈阳 110847)



·基础研究·

补中益气汤对A549/DDP与A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生长的影响

高 原 王 莹 陈 奇1井 欢 于 丹 潘 茜 王 哲 刘春英

(辽宁中医药大学基础医学院病理教研室，辽宁 沈阳 110847)

目的 观察补中益气汤对A549/DDP与A549荷瘤BALB/c小鼠移植瘤生长的影响。方法 BALB/c小鼠右腋窝皮下接种A549/DDP或A549细胞株，成瘤后连续腹腔注射顺铂25 d，2次/d，中药治疗组同时连续灌胃低、中、高剂量补中益气汤25 d，2次/d。给药后0、5、10、15、20、25 d，测量移植瘤的长径与短径，计算移植瘤的体积并绘制肿瘤的生长曲线。实验结束后处死小鼠，剥离瘤组织并称重，计算药物抑瘤率及抑瘤作用提高率。结果 对于A549/DDP移植瘤，给药10 d后，补中益气汤开始缩小移植瘤体积，随着给药时间的延长和给药剂量的增加，移植瘤体积逐渐缩小；给药25 d后，随着补中益气汤剂量的增加，移植瘤重量随之减轻，抑瘤率随之增加，抑瘤作用提高率也随之显著增加。对于A549移植瘤，给药5 d后，补中益气汤即开始缩小移植瘤体积，随着给药时间的延长和给药剂量的增加，移植瘤体积逐渐缩小；给药25 d后，随着补中益气汤剂量的增加，移植瘤重量随之减轻，抑瘤率随之增加，抑瘤作用提高率也随之显著增加。结论 补中益气汤能抑制BALB/c肺腺癌荷瘤小鼠肿瘤的生长，在顺铂耐药与顺铂敏感的肺癌组织中均可发挥抑瘤作用。

补中益气汤；A549/DDP；A549；移植瘤；BALB/c小鼠

肺癌以非小细胞肺癌(NSCLC)多见，占80%～85%；确诊时70%的NSCLC多已发生淋巴结和(或)远处脏器转移，因此，NSCLC的治疗多以化学治疗为主〔1〕。NSCLC一线治疗方案以铂类为基础的联合化疗为首选，但越来越多的患者表现出对铂类药物产生耐药性，这种耐药性还造成了患者对放疗或其他不同药理机制的化学药物的敏感性降低〔2〕，严重影响NSCLC的临床疗效。研究表明补中益气汤可有效提高机体免疫水平〔3〕，抑制瘤组织中的自由基〔4〕，抑制瘤体的生长及延长带瘤机体的生存时间〔5〕，有效改善肺癌耐药〔6〕，提高肺癌临床疗效等。本课题组前期体外实验结果显示补中益气汤含药血清可抑制A549/DDP细胞的生长〔7,8〕，干扰其对顺铂产生耐药性，但对补中益气汤抑制肿瘤生长，改善肿瘤顺铂耐药的体内研究鲜有报道。本实验拟观察补中益气汤对小鼠负荷的A549/DDP和A549移植瘤体积、重量、生长曲线及抑瘤率的影响，探讨其对肿瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞株 BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，6周龄，雄性，体重16～20 g，动物许可证号SCXK(京)2012-0001。A549/DDP及A549均购于中国医学科学院肿瘤研究中心。

1.2 化疗药物及中药 顺铂购于大连美仑生物技术有限公司。补中益气汤根据2010版《中华人民共和国药典》中规定用药及临床常用剂量(黄芪18 g，人参6 g，白术9 g，甘草9 g，当归3 g，陈皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g)，全部药材均购于辽宁中医药大学附属医院药房，通过辽宁中医药大学药理实验室的鉴定，加水浸泡30 min后，按汤剂常规方法煎熬，过滤并浓缩成生药含量为1 g/ml的药液，冷却后4℃保存。按照“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出裸鼠等效剂量，设高剂量浓度为5.82 g/kg、中剂量浓度为2.91 g/kg、低剂量浓度为1.46 g/kg。

1.3 试剂 DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清均购于美国HyClone公司。

1.4 移植瘤动物模型的制备 在37℃、5% CO2孵育条件下，A549、A549/DDP细胞分别在含有10%胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培养液中培养。细胞以0.25%的胰酶消化传代，每隔1～2 d传代一次。分别将收集好的对数生长期的A549/DDP或A549细胞株，用无血清培养基调整细胞浓度至5×107/ml，按相应实验分组接种0.2 ml肿瘤细胞于裸鼠腋窝皮下。接种肿瘤细胞8 d成瘤即移植瘤动物模型制备成功。

1.5 实验分组及给药 60只BALB/c 小鼠适应性喂养2 w，按随机数字表法分为10组，A组(A549/DDP荷瘤对照组)、B组(A549/DDP荷瘤+顺铂组)、C组(A549/DDP荷瘤+顺铂+低剂量补中益气汤组)、D组(A549/DDP荷瘤+顺铂+中剂量补中益气汤组)、E组(A549/DDP荷瘤+顺铂+高剂量补中益气汤组)、a组(A549荷瘤对照组)、b组(A549荷瘤+顺铂组)、c组(A549荷瘤+顺铂+低剂量补中益气汤组)、d组(A549荷瘤+顺铂+中剂量补中益气汤组)、e组(A549荷瘤+顺铂+高剂量补中益气汤组)，每组6只，造模成功后隔天开始给予不同药物干预。A组、a组蒸馏水灌胃，1 ml/只，2次/d；B组、b组10 mg/kg顺铂腹腔注射，2次/d；C组、c 组低剂量补中益气汤灌胃1 ml/只，2次/d，同时10 mg/kg顺铂腹腔注射，2次/d；D组、d组中剂量补中益气汤灌胃1 ml/只，2次/d，同时10 mg/kg顺铂腹腔注射，2次/d；E组、e组高剂量补中益气汤灌胃1 ml/只，2次/d，同时10 mg/kg顺铂腹腔注射，2次/d。分别于给药后0、5、10、15、20、25 d用游标卡尺测量皮下移植瘤的最大长径(a)和横径(b)，计算移植瘤体积：移植瘤体积= a×b2/2，缓制肿瘤生长曲线。给药后25 d时处死全部BALB/c 小鼠，无菌剥取移植瘤并称其质量；计算各组药物的抑瘤率：抑瘤率=(对照组瘤质量-药物组瘤质量)/对照组瘤质量×100%；抑瘤作用提高率(%)=(药物组抑瘤率-对照组抑瘤率)/对照组抑瘤率×100%。

2 结 果

2.1 BALB/c小鼠的一般状态及致瘤率 各组BALB/c小鼠荷瘤后活动良好，未出现明显的拒食、躁动、便溏等症状。荷瘤8 d后，各组BALB/c小鼠均有肿瘤结节生长，瘤块直径达到2～3 mm，经病理学诊断符合肺腺癌组织学特征。各组BALB/c小鼠致瘤率均达到100%。

2.2 给药后不同时点各组荷瘤BALB/c小鼠移植瘤的体积及肿瘤生长曲线 在A549/DDP细胞荷瘤BALB/c小鼠各组中，单独顺铂治疗20 d后移植瘤体积开始缩小，25 d后缩小更为显著，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；而联合补中益气汤治疗10 d后移植瘤体积就开始缩小，与对照组、顺铂组比较均有统计学差异(P<0.05)。随着治疗时间的延长以及中药浓度的增加，移植瘤体积缩小的幅度进一步加大，呈现显著的时间依赖性和剂量依赖性。见表1。在A549细胞荷瘤BALB/c小鼠各组中，单独顺铂治疗5 d后移植瘤体积就开始缩小，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)，其后随着治疗时间的延长，移植瘤体积逐渐缩小；而联合补中益气汤治疗5 d后移植瘤体积较顺铂组进一步缩小(P<0.05)。随着治疗时间的延长以及中药浓度的增加，移植瘤体积缩小的幅度进一步加大，呈现显著的时间依赖性和剂量依赖性。见表2。

表1 A549/DDP荷瘤BALB/c小鼠各组移植瘤体积

与A组比较:1)P<0.05；与B组比较:2)P<0.05

2.3 给药25 d后各组移植瘤瘤重、抑瘤率及抑瘤作用提高率 在A549/DDP细胞荷瘤BALB/c小鼠各组中，单独顺铂治疗后移植瘤体积轻度缩小，移植瘤重量轻度减轻，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；联合低、中、高剂量的补中益气汤治疗后移植瘤体积均显著缩小，移植瘤重量均显著减轻，与对照组、顺铂组比较均有统计学差异(P<0.05)，随着补中益气汤剂量的增加，移植瘤体积随之缩小，移植瘤重量随之减轻，抑瘤率随之增加，抑瘤作用提高率也随之显著增加。见表3。

表2 A549荷瘤BALB/c小鼠各组移植瘤体积

与a组比较:1)P<0.05；与b组比较:2)P<0.05

在A549细胞荷瘤BALB/c小鼠各组中，单独顺铂治疗后移植瘤体积就已显著缩小，移植瘤重量也已显著减轻，与对照组比较有统计学差异(P<0.05)；联合低、中、高剂量的补中益气汤治疗后移植瘤体积进一步缩小，移植瘤重量进一步减轻，与对照组、顺铂组比较均有统计学差异(P<0.05)，随着补中益气汤剂量的增加，移植瘤体积随之缩小，移植瘤重量随之减轻，抑瘤率随之增加抑瘤作用提高率也随之增加。见表4。

表3 A549/DDP细胞荷瘤裸鼠各组移植瘤重量、抑瘤率及抑瘤作用提高率

与A组比较:1)P<0.05；与B组比较:2)P<0.05

表4 A549细胞荷瘤裸鼠各组移植瘤重量、抑瘤率及抑瘤作用提高率

与a组比较:1)P<0.05；与b组比较:2)P<0.05

3 讨 论

肺癌属“肺积”、“痞癖”、“咳嗽”、“咯血”等范畴，其病机特点是全身虚为本，局部瘀痰毒互结成积为标，正虚不仅是肺癌发生的内因，也是肺癌转变的重要因素，而其中正气不足又以后天脾胃虚弱为基础，土不生金为关键。脾肺两脏关系密切，为母子之脏，脾土能生肺金。由于脾气虚衰，水湿不运，湿浊内生，化痰成饮，而痰饮则上传至肺，聚集于肺，形成痰湿瘀滞；同时脾气虚衰，运化失司，水谷精微化源不足，导致肺气不足，即为土不能生金。因此，金元时期著名医家李东垣在《脾胃论》中曰：“其治肝、心、肺、肾，有余不足，或补或泻，惟脾胃之药为切”。培土生金法适用于脾肺同虚症，即肺癌晚期患者〔9〕，此时患者由于病久肺气本虚，邪踞胸中日久更伤肺气，肺气亏虚，子病及母，累及脾胃；加之化疗药进一步损伤脾胃，脾胃虚衰导致气血生化无源，更使正气亏虚、气血瘀滞，故临床肺病经久不愈，易产生耐药〔10〕。

补中益气汤即为李东垣《内外伤辨惑论》的经典方，该方中重用黄芪，补中益气、升阳固表；参、术、草甘温益气、健脾益胃；橘皮理气行滞；当归补血和营；升麻、柴胡协同芪、参以升举清阳之气，全方健脾胃以治气虚之本，升提下陷阳气，以达培土生金之效。

顺铂对耐药肿瘤的抑制生长作用起效时间(>25 d)显著慢于敏感肿瘤(5 d)。联合补中益气汤后，无论是在耐药还是敏感肿瘤中，顺铂抑制肿瘤生长的作用均增强且顺铂对耐药肿瘤抑制生长起效时间提前(10 d)。补中益气汤对耐药肿瘤与敏感肿瘤均表现出时间依赖性抑制和剂量依赖性抑制作用。给药25 d后，顺铂仍对耐药肿瘤的生长无抑制作用，而对敏感肿瘤的生长呈显著抑制。随着补中益气汤剂量的增加，顺铂抑制肿瘤生长的作用逐渐加强，可在顺铂耐药与顺铂敏感的肿瘤中均可发挥有效的抑瘤作用。

1 Hu L,Liang G,Yuliang W,etal.Assessing the effectiveness and safety of liposomal paclitaxel in combination with cisplatin as first-line chemotherapy for patients with advanced NSCLC with regional lymph-node metastasis:study protocol for a randomized controlled trial(PLC-GC trial)〔J〕.Trials,2013;14:45.

2 Chang A.Chemotherapy,chemoresistance and the changing treatment landscape for NSCLC〔J〕.Lung Cancer,2011;71(1):3-10.

3 黄秋萍.补中益气汤及其拆方的免疫调节作用〔J〕.医学导刊，2008;14(2)：72-3.

4 江蔚新，蒋 燕，李宇彬，等.补中益气汤对EAC小鼠癌细胞膜LPO含量的影响〔J〕.黑龙江医药，1997;10(2)：88-9.

5 李 滨，齐凤琴，李燕敏，等.补中益气汤抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.中医药学报，2006;34(1)：22-3.

6 韩 烨，郑 心.培土生金法在中晚期肺癌治疗中的应用〔J〕.江西中医药，2015;4(3)：43-4.

7 易佳丽，刘春英.补中益气汤含药血清干扰A549/DDP生长作用的实验研究〔J〕.中国医药导报，2013;10(17)：4-7.

8 井 欢，唐 莹，于 丹，等.补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞生长周期作用的影响〔J〕.中国生化药物杂志，2014;34(2)：48-50.

9 叶霈智，田劭丹.培土生金法在肺癌治疗中的应用浅析〔J〕.实用中医内科杂志，2005;19(5)：397-8.

10 张 芳，孟宪明.培土生金法对气虚痰湿型肺癌化疗减毒增效的临床研究〔J〕.西部中医药，2014;27(10)：94-5.

〔2015-12-30修回〕

(编辑 郭 菁)

Effect of Buzhong Yiqi decoction on the growth of transplantation tumor of BALB/c mice with A549/DDP cells and A549 cells

GAO Yuan, WANG Ying, CHEN Qi,et al.

Department of Pathology, College of Basic Medical Science, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning, China

Objective To observe the effect of Buzhong Yiqi decoction on the growth of transplantation tumor of BALB/c mice with lung adenocarcinoma cisplatin-resistant cells (A549/DDP) and cisplatin-sensitive cells (A549).Methods The lung tumor-bearing model was established by inoculation of A549/DDP cells and A549 cells into BALB/c nude mice subcutaneously. The mice were treated by intraperitoneal injection of cisplatin for 25 d, twice per day. Simultaneously, the animals in traditional Chinese medicine groups also were put into low, medium and high dose of Buzhong Yiqi decoction for 25 d, twice per day. At 0, 5, 10, 15, 20, 25 d，the long and short diameter of transplantation tumor were measured, then the volume was calculated and the growth curve of tumor was drew. At last, all the mice were executed. The weight of transplantation tumor was weighed, then the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate were calculated.Results For transplantation tumor with A549/DDP cells, Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor after 10 d of administration, and lost the weight of transplantation tumor, increased the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate after 25 d of administration. For transplantation tumor with A549 cells, Buzhong Yiqi decoction reduced the volume of transplantation tumor after 5 d of administration, and lost the weight of transplantation tumor, increased the tumor inhibitory rate and tumor inhibitory increasing rate after 25 d of administration.Conclusions Buzhong Yiqi decoction could inhibit the growth of transplantation tumor of BALB/c mice. It might play a role in a tumor suppressor in the cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant lung tumor tissues.

Buzhong Yiqi decoction; A549/DDP；A549；Transplantation tumor; BALB/c mice

国家自然科学基金项目(No.81403303)；中国博士后科学基金面上资助(No.2014M551122)；中国博士后科学基金特别资助(No.2015T80266)；辽宁省自然科学基金项目(No.2013020178)

1 辽宁省体育科学研究所生理研究室

刘春英(1962-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事中医药治疗肿瘤机制的研究。

高 原(1980-)，女，博士，副教授，主要从事中药调节肿瘤耐药作用及其机制的研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)19-4673-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.001