怀府胎菊等五种中草药不同组合体外抑菌效果比较

王玉姣，刘冰璇，董佳琦，金三俊，刁新平*

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；

2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；

3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

怀府胎菊等五种中草药不同组合体外抑菌效果比较

王玉姣1，刘冰璇2，董佳琦3，金三俊3，刁新平3*

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；

2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；

3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

中草药抗菌谱广，毒副作用小，无残留，可以联合使用，选取怀府胎菊、紫花地丁、黄柏、甘草、芦根5种中药两两不同组合进行抑菌实验。每种中草药设置Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5组进行重复试验，取其平均值，进行抑菌效果的分析。结果表明，在单味药试验中甘草对大肠杆菌活性的抑制效果最佳，黄柏次之；在两两不同组合中甘草+黄柏的抑菌圈直径为12.86 mm，芦根+甘草的抑菌圈直径为12.42 mm，芦根+黄柏11.8 mm，甘草+黄柏、芦根+甘草和芦根+黄柏对大肠杆菌的抑菌效果最佳，菊花+甘草、菊花+黄柏、地丁+甘草和地丁+黄柏对大肠杆菌的抑制效果次之，而菊花+地丁、菊花+芦根和地丁+芦根对大肠杆菌的抑制效果最弱。

中草药；大肠杆菌；药敏试验；抑菌

近些年来，随着大气污染、水污染等环境污染的日益严重，在各养殖场中因为养殖环境差等原因，造成家畜、家禽的健康出现了各种问题，因此在饲料中添加超剂量的抗生素药物的现象非常普遍。抗菌药物的滥用使细菌产生了耐药菌株，在动物体内及其产品中会有不等量的药物残留。随着这种现象的日益发展，不仅动物体会受到影响，人类的健康也得不到保证。经常摄入低剂量的抗生素残留物，会在体内逐渐累积，导致各种器官发生病变。抗生素的残留物对人体的影响主要表现在会发生过敏反应、免疫抑制、致畸、致癌、致突变等作用[1-2]。要寻找一个更为健康有效的抗菌途径，寻找减少药物残留和对动物体和人体危害较小的药物成为当今研究的热点[3]。

中草药作为中华民族的传统文化遗产，在我国应用于人畜疾病的防治已有几千年的历史，与中华民族的文明一样悠久。中草药取药天然，起效方式全面，抗菌谱广，毒副作用小，基本无残留，可以联合使用，因此中草药越来越受到国内外研究人员的关注[4]。采用中草药能对抗多种病原微生物毒素，还能阻止毒素对机体的损害作用，对于一些已对抗生素产生耐药性的细菌，中草药对其仍然有良好的效果[5-6]。

中草药作为饲料添加剂添加到饲料中具有无抗药性、天然、资源丰富、减少药物残留和多种生物活性等优点，在促进动物体生长、提高饲料转化率、增强机体免疫力、抗菌驱虫、提高生产性能和繁殖力、减少动物的应激反应、改善动物性产品品质等方面起到良好作用[3]。目前在饲料添加剂中广泛使用化学合成药物、抗生素等来预防动物腹泻，促进动物生长，但是在饲料添加剂中长期使用抗生素会使各种致病菌产生耐药性，使治疗效果下降。因此，在国内外对中草药的研究和开发越来越受到社会各界的关注。

1 中草药的功能及其对大肠杆菌抑制作用

1.1 中草药的功能

1.1.1 防治疾病

在西医中，在诸多病毒性传染病的治疗过程中，都没有较好的方法。疫苗似乎是个有效的预防途径，但在实际生产过程当中，疫苗在使用过程中可能会引起个别个体的过敏现象。中草药防治疾病的基本作用就在于祛除病邪，消除病因，扶本固正，恢复和重建脏腑经络功能的协调，纠正阴阳不协调的病理现象，使机体在最大程度上能达到阴阳平衡的正常状态[7]。

1.1.2 增强机体的免疫力

现代医学研究表明，中草药的成分复杂多样，这些成分在动物体内能够全面调整和充分发挥动物体自身的免疫功能和适应力。中药中的多糖能激活机体的免疫细胞，能影响机体的补体系统，诱导细胞因子的产生[8]。试验表明，板蓝根多糖可使正常小鼠脾脏的重量增加，并可使被氢化可的松影响导致质量变小的小鼠脾脏恢复到正常水平[9]。

1.2 大肠杆菌

1.2.1 大肠杆菌的流行病学

大肠杆菌病是由大肠杆菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病总称。病原性大肠杆菌的许多血清型都能引起家畜和家禽发病。大肠杆菌病一年四季都可以发生，以幼龄畜、禽最易感染。犊牛和羔羊多发生在冬天、春天舍饲期间。大型集约化养殖厂畜（禽）养殖密度过大、换气通风不良、饲养用具和环境消毒不彻底是加快本病流行的原因。

1.2.2 大肠杆菌对动物体的危害

仔猪发生黄痢时候，潜伏期较短，出生后12 h以内即可发病，会波及一窝仔猪的90%，死亡率很高[10]。体温正常、突然发生脱水、水肿、消瘦。发生白痢时，整窝仔猪的发病率会达到80%，但死亡率比较低，能自然康复。

1.2.3 中草药在大肠杆菌防治中的意义

近年来，由于在养殖场中抗生素等化学药物的滥用，致病性大肠杆菌对于土霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗菌药物表现出耐药性，而且这种耐药性的比率有逐年升高的趋势[4]。中草药是中华民族的传统文化遗产，在我国用于人畜疾病的预防和治疗已有几千年的历史。中草药具有抗菌谱广、不易产生耐药性、可以联合使用等优点。

本试验选取焦作怀府胎菊、黄柏、紫花地丁、芦根和甘草来对大肠杆菌进行体外抑菌实验。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 中草药

本次试验使用的中药为焦作怀府胎菊、黄柏、紫花地丁、甘草、芦根。怀府胎菊购自焦作市武陟县焦作怀盛怀药保健品有限公司，生产批号20140516；芦根，由安徽省亳州市永刚饮片厂有限公司生产，生产批号140821；黄柏、甘草、紫花地丁购于洛阳市张仲景大药房。

2.1.2 试验试剂

普通营养琼脂，由北京奥博星生物技术公司生产，生产批号20130208、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、缓冲液、蒸馏水。

2.1.3 试验用具

三角瓶、烧杯、玻璃棒、培养皿、试管、电炉（电磁炉）、滤纸片、镊子、电热恒温两用培养箱、超净工作台（SW-CJ-1F型单人双面净化工作台）、无菌纱布、天平、直尺、火柴、酒精灯、打孔器、消毒棉签、接种环、砂锅、无菌注射器、pH试纸、大肠杆菌（大肠杆菌由河南科技大学动物科技学院微生物试验室提供）。

2.2 试验方法

2.2.1 大肠杆菌的复苏与培养

液体培养基的制备：用电子天平分别称取牛肉膏1 g，蛋白胨3.3 g，氯化钠1.7 g，倒入烧杯中，用量筒量取蒸馏水333 mL倒入烧杯中，在电炉上边加热边搅拌（烧杯下放置石棉网），使其完全溶解，形成透明溶液，待其冷却后，调节pH，使其pH为7.2～7.4，倒入锥形瓶中，加塞子，在高压灭菌锅中121℃灭菌15 min，取出备用。

2.2.2 药敏片的制备和培养基的制备

药敏片的制备：取滤纸用7 mm打孔器进行打孔制备药敏片。将药敏片装入清洁的青霉素瓶中，高压灭菌锅121℃灭菌15 min备用。

培养基的配制：按照营养琼脂的说明，每33 g普通营养琼脂粉加1 000 mL蒸馏水，按照1:1.3的比例，要称取奥博星普通营养琼脂42.9 g，加蒸馏水1 300 mL。

2.2.3 中药的熬制

用传统煎煮方法进行中药熬制。用电子天平分别称取怀府胎菊、紫花地丁、甘草、芦根、黄柏各30 g，用清水洗去泥沙，放入烧杯中分别加200 mL蒸馏水，浸泡30min后，分别加入不同的砂锅中，加蒸馏水100 mL煎煮，在电炉上加热至沸腾后小火维持30 min，用四层纱布过滤倒入小烧杯中，将过滤过的药渣再加蒸馏水约100 mL，按先前的方法进行熬制过滤，将两次滤液合并，高温浓缩至30 mL（即为1 mL药液中含有1 g生药），用瓶子分装好后高压灭菌15 min，放入4℃冰箱备用[4]。

2.2.4 药敏实验

本试验采用平板纸片琼脂扩散法（抗菌药物纸片琼脂扩散法敏感试验）。

5种单味中草药对大肠杆菌的抑菌实验：将灭过菌的滤纸片（直径为7 mm）在怀府胎菊、紫花地丁、黄柏、甘草、芦根单味水煎剂中浸泡5min，每味药物水煎剂中的药敏片不少于5片，自然沥干，贴在琼脂平板表面，盖严培养皿，此操作均在酒精灯火焰附近进行，防止培养基被其他菌污染。每个平板上均匀地放置5个药敏片，保持相邻两孔的距离≥2 cm，分别做好标记。每种药物做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5个对照。放入培养箱中34℃培养14～24 h后取出，用直尺测量各纸片周围无菌圈直径，算其平均值。

5种中药两两不同组合对大肠杆菌的抑菌试验：5种中药水煎剂体积1∶1两两混合，即得到A组怀府胎菊+紫花地丁、B组怀府胎菊+甘草、C组怀府胎菊+芦根、D组怀府胎菊+黄柏、E组紫花地丁+甘草、F组紫花地丁+芦根、G组紫花地丁+黄柏、H组甘草+芦根、I组甘草+黄柏、J组芦根+甘草这十种不同组合，放至于不同灭过菌的烧杯中，与上述方法相同，进行药敏实验，测量抑菌圈直径，算其平均值。抑菌圈直径≤10 mm抑制强度为弱，抑菌圈直径界于10～11 mm抑制强度为中，抑菌圈直径≥12 mm抑制强度为强。

3 试验结果

3.1 5种单味中药对大肠杆菌活性的影响

3.1.1 观察药敏片周围细菌的生长情况

在培养箱中培养14 h后，取出培养皿，观察培养皿上大肠杆菌的生长情况，在培养基表面没有放药敏片及离药敏片较远的地方可以看到，均匀地布满了圆形凸起、表面光滑、边缘整齐、半透明、近似灰白色的菌落。全部的药敏片周围都出现了大小不等的边界较为清晰的抑菌圈。

3.1.2 测量并记录药敏片周围无菌圈直径的大小

全部的药敏片周围都出现了大小不等的边界较为清晰的抑菌圈，测量抑菌圈直径，求其平均值得到甘草和黄柏的抑菌圈较大，依次为10.42 mm和10.16 mm，而另外3种中草药的抑菌圈相对较小，芦根的抑菌圈大小为9.18 mm，菊花的抑菌圈大小为8.14 mm，紫花地丁的抑菌圈大小为7.38 mm。由以上试验数据可得到结论，5种单味中草药的水煎剂对大肠杆菌都能产生不同程度的抑制作用，其对大肠杆菌的抑制强弱排序为：甘草＞黄柏＞芦根＞菊花＞紫花地丁。甘草和黄柏对大肠杆菌的抑制效果较强，芦根和菊花对大肠杆菌的抑制效果次之，紫花地丁对大肠杆菌的抑制效果最弱。

3.2 5种中药的不同组合对大肠杆菌活性的影响3.2.1观察药敏片周围细菌的生长情况

同样在培养箱中34℃培养14 h后，取出培养皿，观察培养皿上大肠杆菌的生长情况。

3.2.2 测量并记录药敏片周围无菌圈直径的大小

5种中草药两两不同组合对大肠杆菌的敏感性测试见表1。

表1 5种中草药两两不同组合对大肠杆菌的敏感性测试

由表1可知，这5种中草药两两不同组合对大肠杆菌的敏感性试验敏感程度不同，但相对于单味中药对大肠杆菌的抑制效果来说，两两不同组合的中药提取物对大肠杆菌的抑制效果都有不同程度的增加，其中，甘草+黄柏和甘草+芦根组合的抑菌圈直径增加最为明显。5种中药两两不同组合对大肠杆菌在体外活性的抑制效果顺序为：甘草+黄柏＞芦根+甘草＞芦根+黄柏＞菊花+甘草＞菊花+黄柏＞地丁+甘草＞地丁+黄柏＞地丁+芦根＞菊花+芦根＞菊花+地丁。甘草+黄柏的抑菌圈直径为12.86 mm，芦根+甘草的抑菌圈直径为12.42 mm，芦根+黄柏的抑菌圈直径为11.8 mm，甘草+黄柏、芦根+甘草和芦根+黄柏对大肠杆菌在体外的抑制效果较强；菊花+甘草的抑菌圈直径为10.76 mm，菊花+黄柏的抑菌圈直径为10.52 mm，地丁+甘草的抑菌圈直径为10.44 mm，地丁+黄柏的抑菌圈直径为10.1 mm，菊花+甘草、菊花+黄柏、地丁+甘草和地丁+黄柏对大肠杆菌在体外的抑制效果次之；地丁+芦根的抑菌圈直径为9.44 mm，菊花+芦根的抑菌圈直径为9.36 mm，菊花+地丁的抑菌圈直径为8.5 mm，地丁+芦根、菊花+芦根和菊花+地丁对大肠杆菌在体外的抑制效果较弱。

4 分析与讨论

本试验中单味中草药对大肠杆菌的抑制程度甘草最强，平均抑菌圈直径为10.42 mm，黄柏次之，抑菌圈直径为10.16 mm，表明甘草、黄柏在体外对大肠杆菌活性的抑制效果最好，菊花、芦根的抑菌效果一般，而地丁无明显抑菌效果。

这5种中草药两两组合以后，药液的抑菌作用都得到了一定程度的增强，其中甘草+黄柏和甘草+芦根效果增加最为明显。甘草+黄柏、芦根+甘草和芦根+黄柏对大肠杆菌在体外的抑制效果较强，菊花+甘草菊、花+黄柏、地丁+甘草和地丁+黄柏对大肠杆菌在体外的抑制效果次之，地丁+芦根、菊花+芦根和菊花+地丁对大肠杆菌在体外的抑制效果较弱，这些可能与各种中草药的产地、成分和性能有关。

黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮。经动物试验表明，黄柏煎剂、水浸出液或乙醇浸出液对化脓性细菌的抑制作用较强，如绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌都有较强的抑制效果[11]。黄柏能增强白细胞的吞噬能力，提高机体的非特异性免疫力。临床应用方面最新报道，黄柏对治疗口腔扁平苔藓、流行性脑脊髓膜炎、痔疮合并感染、烧烫伤、慢性咽炎等各类病症或感染性疾病都具有良好的疗效[12]。

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁的干燥全草。紫花地丁对金黄色葡萄球菌、腐生菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、变形杆菌均有抑制作用，但对金黄色葡萄球菌和腐生菌的抑制作用较强。紫花地丁水提物对角叉菜胶致炎小鼠具有显著的抗炎作用，其抗炎作用机制可能与降低角叉菜胶致炎小鼠血清TNF-α，IL-1β及炎性组织中PGE2含量的表达有关[13]。

芦根为禾本科植物芦苇的干燥根茎。芦根中的天门冬酰胺能有效地抑制癌细胞的生长、扩散并能使癌细胞生长正常化。

杭白菊还未完全开放时采摘的菊花称为胎菊，试验所用的胎菊产自河南省焦作市武陟县，武陟县是怀庆府之中的一个县，因此称为怀府胎菊。相关资料表明，胎菊在体外对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、变形菌以及绿脓杆菌和霍乱弧菌等细菌具有完全的抑制作用，对人体的结核杆菌可产生抑制效果，菊花对中枢神经也有抑制作用。

甘草性平，味甘，气微。归心、肺、脾、胃经。甘草的化学组成较为复杂，目前为止从甘草中分离出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草苷、新甘草苷、甘草素、异甘草素等数10种化合物，但这些成分和数量通常会随甘草的种类、种植区域、采收时间等因素的不同而不同[14]。大量的试验研究表明，甘草甜素和黄酮类物质是甘草中最重要的生理活性物质，主要存在于甘草根表皮以内的部分。

目前的许多试验表明，很多中草药具有抑菌杀菌作用，其作用的有效成分也较为多样，其有效成分多为挥发油、有机酸、生物碱、萜类、黄酮、醌类、多糖类等[15]。

试验结果表明，单味中草药中黄柏和芦根对大肠杆菌的抑制效果最强。不同中药的两两组合中黄柏+芦根、黄柏+芦根和芦根+甘草的抑菌效果较为明显，菊花+甘草、菊花+黄柏、地丁+甘草和地丁+黄柏对大肠杆菌的抑制效果一般，而菊花+地丁、菊花+芦根和地丁+芦根对大肠杆菌的抑制性较弱。中草药两两不同组合的药性增加可能与中药中活性物质的互相协同有关。

5 结论

怀府胎菊、紫花地丁、甘草、芦根和黄柏这5种中草药的水煎剂对大肠杆菌有一定的抑制效果，这5种中草药两两组合后，对大肠杆菌的抑制效果有一定的增强，其中黄柏+芦根、黄柏+甘草和芦根+甘草的抑菌效果最为明显。

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Comparison of Antibacterial Effect of Five Kinds of Different Combinations of Chinese Herbal Medicinein Vitro

WANG Yujiao1,LIU Bingxuan2,DONG Jiaqi3,JIN Sanjun3,DIAO Xin ping3*

（1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;
2.College of Resources and Environment,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;
3.College of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Traditional Chinese medicine,with the feature of natural,comprehensive,widely antimicrobial spec⁃trum,little side effect and no residue.They could be used in combination,choosing the Huai Fu fetal chrysanthemum, Herba Violae,Corktree bark,liquorice,Rhizoma Phragmitis five kinds of traditional Chinese medicine pairwise differ⁃ent combinations and tested the bacteriostasis experiment.Using paper disc agar diffusion method,sensitivity tests were performed on the Escherichia coli and traditional Chinese medicine used the traditional decocting method,the first antimicrobial tests of single flavor Chinese herbal medicine.Each herb was setⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴrepeated experi⁃ments were carried out,and their average values were taken,the antibacterial effect was analyzed.The results showed that in the test of single herbs liquorice inhibitory effects on the activity of Escherichia coli best was Cortex Phelloden⁃dri.In pairwise combinations of different Glycyrrhiza+Cortex Phellodendri bacteriostatic circle diameter was 12.86 mm.The inhibition zone diameter of reed rhizome and licorice was 12.42 mm,reed rhizome and Cortex Phellodendri was 11.8 mm,antibacterial effect of licorice root and phellodendron bark,reed rhizome and licorice root and Rhizoma Phragmitis and Cortex Phellodendri on Escherichia coli was the best,chrysan⁃themum and liquorice,chrysanthemum and Cortex Phellodendri,Viola yedoensis+licorice and Viola ye⁃doensis and Cortex Phellodendri inhibitory effect on Escherichia coli was better,chrysanthemum+violet, chrysanthemum+Rhizoma Phragmitis and violet+Phragmites on Escherichia coli inhibitory effect was the weakest.

Traditional Chinese medicine(TCM);E.coil,drug sensitivity test;antibacterial

R286；R285.6

A

1001-0084（2016）10-0026-06

2016-09-14

黑龙江省科技厅对外合作攻关项目（WB13B101）

王玉姣（1990-），女，河南浚县人，硕士研究生，研究方向为预防兽医微生物与免疫。

*通讯作者：副教授，硕士生导师，E-mail:diaoxp63@163.com。