甲苯对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响研究

何理平，曹彩辉，吴端生

（1.南华大学实验动物学部，湖南 衡阳 421001；

2.湖南省双峰县中医院，湖南 双峰 417700）

甲苯对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响研究

何理平1，曹彩辉2*，吴端生1

（1.南华大学实验动物学部，湖南 衡阳 421001；

2.湖南省双峰县中医院，湖南 双峰 417700）

为研究甲苯对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响，进行了一系列试验，并对试验数据进行分析和评估。结果表明，甲苯对红鲫鱼具有一定的遗传毒性，会使红鲫鱼的血红细胞的微核率，核异常率和总核异常率产生较大的影响。

甲苯；红鲫鱼；血红细胞；微核

微核检测技术是有毒物质（如甲苯及苯衍生物，除草剂，放射性物质等）对生物细胞遗传损伤检测的一种非常有用的方法[1-7]。有人用鱼类微核试验法评价水载污染及鱼类的毒性效应，认为鱼类微核率可以迅速可靠地反映出机体染色体损伤，DNA复制紊乱等异常状况。

实验红鲫C1HD系（red crucian carp C1HD or⁃laboratory carassius auratus red variety C1HD）是南华大学吴端生等采用人工雌核发育技术培育的一种鱼类近交系[8]。具有体型适当、体色全红、繁殖力强、易饲养等优点，特别适合于作为急性毒性实验、化学品毒性检测、重金属污染和农药杀虫剂污染的监测等实验鱼类。在现代工业高速发展的今天，甲苯及苯衍生物对水的污染也日渐加重，研究甲苯对红鲫鱼的毒理作用，可以对水环境进行监督，对保护人类自身健康有着重要意义[9-10]。

1 试验材料

1.1 试验动物

实验红鲫C1HD系100尾，健康，1.5年龄，平均体长110.5±9.1 mm，体质量45.6±6.4 g，试验前驯养＞2周。试验用鱼采用半静态方式饲养，鱼缸试验用水每天定时更新一半。

1.2 试验用水及试剂

用水为曝气3 d自来水，pH 6.54、溶氧6.21 mg·L-1，水温（20±4）℃，水中不含甲苯。试验试剂为分析纯。

1.3 试验器材

注射器，显微镜，烧杯，玻璃棒，载玻片，盖玻片，增气泵，纱布，温度计，试管。

2 试验方法

2.1 驯养

将红鲫鱼放在试验用的水簇箱中，事先曝气48 h的自来水中驯养1周，使鱼适应试验环境[11]。

2.2 配制甲苯溶液

根据前期试验将甲苯浓度设置为4、8和12 mg·L-13个浓度[12]。

2.3 染毒

将40条红鲫鱼随机分为高、中、低、对照组4组，每组25条，置一水簇箱中，染毒组分别按12、8、4 mg·kg-1（体质量）腹腔注射（从红鲫鱼胸鳍下无鳞片处小心将药水推注入鱼的腹腔中）不同浓度甲苯溶液，对照组注射0.2 mL 0.85%生理盐水。以便于1、3、5、7 d取血制片观察，计数。

2.4 饲养及水环境的维持

每一水簇箱中放一个增气泵来增气增氧，每天上午按大约鱼体重1%投入磨细的鱼饵料1次，每天换水1次，每次换水1/2～2/3。水温保持在23～27℃。

2.5 取血制片

从各处理组中取实验鱼用纱布擦干净，以体侧取血法（将鱼侧卧，从躯干部的侧线鳞基部，将注射针呈50°～70°刺入鱼体，当遇到脊椎骨时，使针尖刺入两个椎体之间，并轻轻转动，便可刺破血管壁，血液随之进入注射器内）取血制片。同时，在注射针筒底部沾少许肝素防止血液凝固[13]。

将血液直接涂在洁净的载玻片上，自然晾干；甲醇固定4 min，瑞氏染色3 min，缓冲液覆盖5 min；冲洗，晾干后在显微镜下观察，计数。

2.6 观察、计数和测定

将血涂片置于油镜下观察，计数，每张涂片至少数40个红细胞，分别记录微核数、微核细胞数、双核数、小核数、无核数、其他核异常数、总异常数，结果以千分率表示。其中，微核为圆形或椭圆形，直径约为主核的1/5～1/4；其他核异常包括核质外凸、核质内凹、核质断裂、核位置明显异常等；总核异常数包括微核数、双核数、小核数、无核数和其他核异常数。

3 试验结果

3.1 甲苯对红鲫鱼血红细胞微核及核异常的影响

染毒1、3、5、7 d后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响见表1～4；染毒对红鲫鱼血红细胞微核、核异常、总核异常数的影响见图1～3。

表1 染毒1 d后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

表2 染毒3 d后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

表3 染毒5 d后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

表4 染毒7 d后对红鲫鱼血红细胞微核和核异常的影响

图1 染毒对红鲫鱼血红细胞微核的影响

图2 染毒对红鲫鱼血红细胞核异常的影响

由表1～4可知，分别染毒后，试验组红鲫鱼活力下降，但未出现死亡。随着甲苯浓度的增加及时间的延长，核异常率也明显在发生变化；从表1～4与图1～3中可知，甲苯对红鲫鱼外周血红细胞的微核率、核异常率及总核异常率是具有一定影响的。微核率、核异常率与总核异常率都明显上升，在用不同浓度的甲苯处理相同时间或用同一浓度处理不同时间后，从表1～4可知，红鲫鱼的微核率、核异常率与总核异常率都明显上升，都明显高于生理盐水对照组的水平。从图1～3可知，红鲫鱼微核率，核异常率与总核异常率均出现一个高峰，但并不一致，由图2可知，各种浓度组核异常率高峰均在第7天。出现高峰的浓度值也不是完全同步的。这种现象的出现可能是由于甲苯影响红鲫鱼的途径很多，抑制纺锤体而产生核异常和使微小核物质滞留质核外的时间及程度并不一致所致[13]。

在处理时间相同的各不同甲苯浓度组中，均以最高浓度组上升最多。由图1～3可知，在处理1、3和5 d的各浓度中，均以12 mg·kg-1组上升最多。表明甲苯浓度越高对红鲫鱼的毒害越大，具有一定的剂量效应。图1显示，高浓度组第3天的微核率较第1天有所下降，原因可能为试验失误或取材红鲫鱼的个体差异所致。由图2可知，第7天高浓度组的核异常率都有所下降而中低浓度组继续上升，分析原因可能是红鲫鱼的个体差异所致，也可能是红鲫鱼对甲苯的毒害产生了一定的抵抗力。

图3 染毒对红鲫鱼血红细胞总核异常数的影响

由表1～3可知，在用同一甲苯浓度处理不同时间各组的比较中，发现每一浓度组中，随着染毒时间的加长，红鲫鱼的血红细胞微核率均有不同程度的上升，具有一定的时间效应。图1表明，高浓度组在第3天的微核率有所降低。由图2可知，在4 mg·kg-1与12 mg·kg-1浓度组中，5～7 d的核异常率有所下降，此现象说明红鲫鱼对甲苯的毒害作用还是有一定抵抗力的，在经过了一段时间以后，通过自身的调节，机体排除有害物质以减小毒害并且抑制核异常的产生[14]。

4 讨论

随着工农业的迅速发展，大量的甲苯及苯衍生物也随着废弃物进入了水体，不仅严重污染了水体环境；同时对水体中的主要动物鱼类，产生了非常严重的危害。鱼类又是人类重要的食物来源，这些受毒害的鱼必将通过食物链而最终危害人类自身的健康。

甲苯及苯衍生物进入动物体内后，具有较为强烈的致突变、致畸和致癌作用，同时又因为甲苯及苯衍生物具有难以被生物分解和较高的富集等特性，当环境中甲苯及苯衍生物的含量超过一定的浓度时，如果长期生活在这样的环境中，就会对包括人类在内的所有生物造成极大的毒害作用[15]。

微核实验是染色体损伤短期突变性试验方法之一，有关微核的产生原因，不同的学者虽有不同的表述，但基本上意见是一致的，即微核是细胞在有丝分裂时因为各种有害因素的损伤，使细胞核残留在核外的微小染色质块，一般认为无着丝粒断片可形成小微核，纺锤体断裂造成的一条或一组染色体滞后可形成大微核。由于微核与染色质的突变具有较为密切的联系，因此长期以来微核被许多科研工作者用来作为评价毒物，放射性物质以及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤的指标。现在微核检测技术是检测有毒物质对生物细胞遗传损伤的一个非常有用的指标，微核率可以迅速、可靠地反映机体染色体损伤及DNA复制紊乱等异常状况[16]。

5 结论

苯及苯衍生物甲苯对红鲫鱼具有一定的遗传毒性，能对红鲫鱼的血红细胞的微核率、核异常率和总核异常率产生较大的影响。

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Effects of Toluene on Micronuclei and Nuclear Anomalies in Red Blood Cells of Red Crucian Carp

HE Liping1,CAO Ca ihui2*,WU Duansheng1
（1.Department of Laboratory Animal,Nanhua University,Hengyang 421001,Hunan,China)
2.Shuangfeng Chinese Medicine Hospital of Hunan Province,Shuangfeng,417700,Hunan,China）

In order to study the effect of toluene on micronuclei and nuclear anomalies in red blood cells of red crucian carp,a series of experiments were done and the test data were analyzed and evaluated.The results showed that toluene had genetic toxicity on red crucian carp,and would impact the red blood cell micronuclei rate,nuclear abnor⁃mal rate andtotal nuclear abnormalities rate of redcruciancarp.

toluene;red crucian carp;red blood cells;micronucleus

O625.11；Q959.4

A

1001-0084（2016）10-0005-05

2016-09-10

湖南省科技厅资助项目（2013TT2015）

何理平（1980-），女，湖南双峰人，硕士，讲师，主要从事实验动物饲养。

*通讯作者