截短型p63基因沉默对胰腺癌PANC1细胞增殖的影响

莫庆荣 喻亚群 李淑群 陈谦 廖维甲



·论著·

截短型p63基因沉默对胰腺癌PANC1细胞增殖的影响

莫庆荣 喻亚群 李淑群 陈谦 廖维甲

目的 观察截短型p63(ΔNp63)基因沉默对胰腺癌PANC1细胞增殖的影响。方法 采用实时PCR检测23例胰腺癌及其配对癌旁正常胰腺组织ΔNp63mRNA的表达；采用蛋白质印迹法检测人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6-C7及人胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC3的ΔNp63蛋白表达。采用脂质体法将靶向ΔNp63的siRNA(ΔNp63-siRNA)及对照siRNA(Con-siRNA)转染PANC1细胞，以未转染的PANC1细胞作为对照组，检测转染细胞ΔNp63 mRNA及蛋白表达以验证ΔNp63基因沉默效应。采用MTT法和BrdU法检测转染细胞的增殖及DNA合成能力的变化。结果 23例胰腺癌及配对癌旁正常胰腺组织ΔNp63 mRNA表达量分别为0.99±0.07、0.70±0.07，癌组织的表达量显著高于正常胰腺组织，差异有统计学意义(P=0.0034)。HPDE6-C7及PANC1、CFPAC-1、BxPC3细胞ΔNp63蛋白表达量分别为0.97±0.09、3.06±0.16、2.57±0.11、2.45±0.08，3株胰腺癌细胞的表达量较HPDE6-C7细胞升高，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。对照组、Con-siRNA组、ΔNp63-siRNA组PANC1细胞ΔNp63mRNA表达量分别为0.97±0.07、0.97±0.07、0.28±0.03，蛋白表达量分别为0.97±0.06、1.00±0.10、0.26±0.03，ΔNp63-siRNA组均较Con-siRNA组显著下调，差异有统计学意义(P值均<0.01)。ΔNp63-siRNA组细胞生长受到抑制，与Con-siRNA组及对照组差异均有统计学意义(P值均<0.01)。3组培养24 h时DNA合成量(A490值)分别为0.55±0.04、0.56±0.01、0.55±0.00；培养48 h时分别为0.84±0.05、0.87±0.07、0.71±0.05。48 h时ΔNp63-siRNA组细胞DNA合成能力较Con-siRNA组及对照组显著下降，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而Con-siRNA组与对照组间的差异无统计学意义。结论 沉默ΔNp63基因可显著抑制胰腺癌PANC1细胞的增殖及DNA合成。

胰腺肿瘤； 基因沉默； 基因，p53； 细胞增殖

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81260328)；the universities Science and Technology Research Foundation of Guangxi (LX2014251)； the Science and Technology Planning Project of Guilin (20120121-1-15)；Guangxi health department key scientific research project funds(key project2012005)

胰腺癌是消化道的恶性肿瘤之一，其病因和发病的分子机制尚不明确[1-2]。近年来，癌基因或抑癌基因变异引起的相关功能因子表达紊乱而导致胰腺癌发生和发展的分子机制研究成为重要方向[3-4]。p63是肿瘤抑制基因p53家族成员，它的某些亚型被认为是肿瘤抑制基因，而另一些亚型被认为是致癌基因。截短型p63(ΔNp63)作为p63的同源体，在多种肿瘤中表现为致癌功能。有研究报道，ΔNp63可通过调节肿瘤血管生成促进小儿神经母细胞瘤和骨肉瘤生长[5]。另有研究报道，在膀胱癌中ΔNp63通过特定的下游基因诱发癌细胞的侵袭力，沉默ΔNp63基因表达可降低UMUC3细胞的浸润和转移[6]。但有关ΔNp63在胰腺癌中的作用尚未见文献报道。本研究拟从细胞、分子和组织3个层面探讨ΔNp63对胰腺癌细胞增殖的调控作用。

材料与方法

一、实时PCR检测ΔNp63 mRNA表达

选取2011年12月至2014年12月间桂林医学院附属医院肝胆胰外科手术治疗并经病理诊断证实的23例胰腺癌组织及其配对癌旁正常胰腺组织。患者术前均未进行任何放、化疗或免疫治疗。手术后0.5～1 h内迅速取组织冻存于液氮备用。取约50 mg的组织块置研钵中研磨成粉末状，采用Trizol抽提组织总RNA。应用分光光度计测定样本A260、A280值鉴定RNA纯度，计算RNA浓度。取50 μg总RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板、以GAPDH为内参进行PCR反应。ΔNp63上游引物为5′-TGCCCAGACTCAATTTAGTGAG-3′，下游引物为5′-TCTGGATGGGGCATGTCTTTGC-3′，扩增片段335 bp；GAPDH上游引物为5′-CGCATAGCATACGGCT-3′，下游引物为5′-GGCATGACTCCGATTG-3′，扩增片段140 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 20 s，40个循环。使用BIO-RAD实时PCR仪自带软件获取Ct值，采用公式2-ΔΔCT计算RNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

二、蛋白质印迹法检测ΔNp63蛋白表达

人正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6-C7及人胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC3均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞复苏后常规培养、传代。应用裂解液提取各组对数生长期细胞的蛋白质，Bradford法定量蛋白。取10 μg蛋白常规行蛋白质印迹法检测ΔNp63蛋白表达量，以GAPDH为内参。鼠抗ΔNp63及GAPDH多抗均购自美国Abcam公司，工作浓度为1∶500、1∶200；抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG购自上海朗顿生物科技有限公司，工作浓度1∶1 600。最后ECL化学发光，X光胶片曝光、显影、定影。用图像分析系统扫描条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、siRNA转染PANC1细胞

取对数生长期PANC1细胞，以每孔2×105个接种于6孔板，待细胞融合至70%～80%时更换无血清培养基，采用Lipo-2000将靶向ΔNp63的siRNA(ΔNp63-siRNA)及对照siRNA(Con-siRNA)转染PANC1细胞，以未转染的PANC1细胞作为对照组。ΔNp63-siRNA、Con-siRNA均购自美国Bio Systems公司，细胞转染试剂Lipo-2000购自美国Life Technology公司。按试剂盒说明书操作。采用实时PCR法及蛋白质印迹法检测转染细胞ΔNp63mRNA及蛋白表达以鉴定基因沉默效应。

四、MTT检测细胞增殖

收集对数生长期的PANC1细胞及ΔNp63-siRNA、Con-siRNA转染的PANC1细胞，调节细胞悬液密度为1×105/ml。取100 μl细胞悬液接种于96孔板，每组设5个复孔。共接种6块培养板，分别常规培养0、1、2、3、4、5 d，到时间点时每孔加入10 μl 0.5% MTT溶液，继续培养4 h，1 000转离心10 min，小心吸掉孔内上清液，加入100 μl二甲基亚砜，低速振荡10 min，上酶联免疫检测仪测各孔在波长490 nm处的吸光度值(A490值)。以单加MTT、培养基、二甲基亚砜的孔调零。

五、BrdU法检测细胞DNA合成能力

取上述各组PANC1细胞，以2×103/ml细胞数接种于96孔板培养1 d，用含0.4% FCS培养液同步化2 d，使绝大多数细胞处于G0期。然后分别培养24、48 h，到培养时间点时加入终浓度为10 μmol/L的BrdU，继续37℃孵育24 h，弃培养液，4%冷的多聚甲醛固定细胞30 min，加过氧化物酶孵育耦合抗BrdU抗体(Sigma-Aldrich公司)60 min，PBS洗涤3次后加过氧化物酶底物(四甲基联苯胺)染色30 min，测各孔在波长490 nm处的吸光度值(A490值)。

六、统计学处理

结果

一、胰腺癌组织及细胞中ΔNp63的表达

23例胰腺癌及配对的癌旁正常胰腺组织ΔNp63 mRNA表达量分别为0.99±0.07、0.70±0.07，癌组织的表达量显著高于正常胰腺组织，差异有统计学意义(t=2.684,P=0.0034)。

HPDE6-C7细胞及人胰腺癌PANC1、CFPAC-1、BxPC3细胞ΔNp63蛋白表达量分别为0.97±0.09、3.06±0.16、2.57±0.11、2.45±0.08，胰腺癌PANC1、CFPAC-1、BxPC3细胞均显著高于HPDE6-C7细胞，差异有统计学意义(P值均<0.01，图1)。

二、ΔNp63-siRNA转染对PANC1细胞的基因沉默效应

对照组、Con-siRNA组、ΔNp63-siRNA组PANC1细胞ΔNp63 mRNA表达量分别为0.97±0.07、0.97±0.07、0.28±0.03；蛋白表达量分别为0.97±0.06、1.00±0.10、0.26±0.03(图2)。ΔNp63-siRNA组PANC1细胞ΔNp63mRNA表达量较Con-siRNA组下调约75%，蛋白表达量下调约80%，差异有统计学意义(t=8.881，P=0.0009;t=7.417,P=0.0018)，而Con-siRNA组与对照组的差异无统计学意义。

图1 HPDE6-C7(1)、PANC1(2)、CFPAC-1(3)、BxPC3(4)细胞ΔNp63蛋白表达

图2 对照组(1)、Con-siRNA组(2)、ΔNp63-siRNA组(3)PANC1细胞的ΔNp63蛋白表达

三、ΔNp63基因沉默对PANC1细胞增殖及DNA合成的影响

ΔNp63-siRNA组细胞生长曲线较Con-siRNA组及对照组显著下降，差异有统计学意义(t=14.4242，P=0.0001；t=11.0147,P=0.0004；图3)。对照组、Con-siRNA组、ΔNp63-siRNA组培养24 h时的DNA合成量(A490值)分别为0.55±0.04、0.56±0.01、0.55±0.00；培养48 h时分别为0.84±0.05、0.87±0.07、0.71±0.05。3组培养24 h时的DNA合成能力差异无统计学意义，培养48 h时，ΔNp63-siRNA组细胞DNA合成能力较Con-siRNA组及对照组显著下降，差异均有统计学意义(t=4.071，P=0.0309；t=3.182,P=0.0354)。

讨论

据《2013年中国肿瘤登记年报》统计，胰腺癌位列我国男性恶性肿瘤发病率的第8位，人群恶性肿瘤死亡率的第7位，全球范围内均呈快速上升趋势。胰腺的肿瘤大多是外分泌型肿瘤，80%是胰腺导管腺瘤，只有2%的胰腺外分泌肿瘤为良性[7]。胰腺癌以高侵袭性和早期转移为特点，临床症状出现晚，发现时多为晚期，很难施行治愈性的手术治疗，预后较差。近几年胰腺癌在我国发病率逐年上升，并且有年轻化的趋势。虽然放疗和化疗对延长患者生存期起到了一定的作用，但是患者中位生存期仍小于2年[8]。

图3 ΔNp63-siRNA转染对ΔNp63细胞增殖的影响

p63不仅对各种上皮细胞的正常发生、分化及维持细胞形态具有重要功能，而且在促进癌细胞凋亡方面也扮演重要角色。p63基因是p53基因家族成员，定位于第3q27～3q29，包含15个外显子。它在两个不同的启动子控制下编码两类转录产物：一类为全长型p63(TAp63)，另一类为截短型p63(ΔNp63)。ΔNp63不具有转录启动活性，但可以抑制TAp63和p53依赖的靶基因的转录，且不诱导细胞凋亡，充当致癌基因的角色[9]。以往研究发现，ΔNp63 mRNA在卵巢癌、鼻咽癌、鳞癌和其他上皮来源的良性肿瘤、软垂疣、平疣中表达[10]。而沉默多种肿瘤细胞ΔNp63基因表达可抑制癌细胞的生长和增殖，所以ΔNp63一直是多种治疗策略的关键点[11-12]。

本研究结果显示，胰腺癌组织及多株胰腺癌细胞株均高表达ΔNp63，通过RNA干扰技术沉默ΔNp63基因表达，可以抑制胰腺癌细胞的增殖和DNA合成，提示 ΔNp63可促进胰腺癌细胞的增殖。

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(本文编辑：吕芳萍)

The effect of ΔNp63 knockdown on the growth of pancreatic cancer PANC1 cells

MoQingrong,YuYaqun,LiShuqun,ChenQian,LiaoWeijia.

DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001,ChinaCorrespondingauthor:YuYaqun,Email: 260591484@qq.com

Objective To investigate the effect of deltaNp63(ΔNp63) silencing on the proliferation of pancreatic cancer PANC1 cells. Methods ΔNp63 mRNA level in 23 pairs of pancreatic cancer and adjacent tissue specimen was detected by real-time PCR, and ΔNp63 protein in human normal pancreatic ductal cell line HPDE6-C7 and pancreatic cancer cell line PANC1, CFPAC1 and BXPC3 was detected by Western blot. PANC1 cells were transfectedΔNp63 specific siRNA (ΔNp63-siRNA) and scramble siRNA (Con-siRNA) using liposome, and untransfected cells served as control.ΔNp63 mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blot to validate the silencing ofΔNp63 expression. MTT assay and BrdU method were used to detect the proliferation and DNA synthesis of transfected PANC1 cells. Results The ΔNp63 mRNA expression

Pancreatic neoplasms; Gene silencing; Genes, p53; Cell prdiferation

国家自然科学基金(81260328)；广西高校科学技术研究基金(LX2014251)；桂林市科技开发课题基金(20120121-1-15)；广西卫生厅重点科研课题基金(重2012005)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.05.005

541001 广西桂林，桂林医学院附属医院肝胆胰外科

喻亚群，Email: 260591484@qq.com

in pancreatic cancer tissues and matched adjacent normal tissues was 0.99± 0.07and 0.70±0.07, respectively. ΔNp63 mRNA expression in pancreatic cancer tissue was significantly up-regulated compared with that in the normal tissue (P=0.0034). The ΔNp63 protein expression in HPDE6-C7, PANC1, CFPAC-1 and BxPC3 cells was 0.97±0.09,3.06±0.16,2.57±0.11 and2.45±0.08, respectively. TheΔNp63 protein level in pancreatic cancer cells were higher than that in HPDE6-C7 cells (P<0.001). ΔNp63 mRNA level in control, Con-siRNA and ΔNp63-siRNA group was 0.97±0.07,0.97±0.07 and0.28±0.03, respectively, and ΔNp63 protein expression level was 0.97±0.06,1.00±0.10 and 0.26±0.03. The expression of ΔNp63 mRNA and protein inΔNp63-siRNA group were significantly down-regulated comparing with those in Con-siRNA group (P<0.01). Significant inhibition on cell proliferation was observed in ΔNp63-siRNA group, which was statistically different from that in control and Con-siRNA group. TheA490value (DNA synthesis) of control, Con-siRNA and ΔNp63-siRNA group was 0.55±0.04, 0.56±0.01 and 0.55±0.00 at 24 h after transfection, and 0.84±0.05,0.87±0.07 and0.71±0.05 at 48 h after transfection. The DNA synthesis in ΔNp63-siRNA group was significantly down-regulated compared with that in control and Con-siRNA group (P<0.05). Conclusions Knockdown of ΔNp63 could greatly inhibit the proliferation and DNA synthesis of pancreatic cancer PANC1 cells.

2016-02-15)