单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度

仲韵

南京医科大学附属淮安第一医院老年科，江苏淮安223300

单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度

仲韵

南京医科大学附属淮安第一医院老年科，江苏淮安223300

目的在罗氏LightCycler 480上建立单色多重荧光实时定量聚合酶链反应（MMQPCR）方法测定端粒长度。方法在罗氏480定量PCR仪上使用MMQPCR方法测定39例人外周血白细胞端粒长度（相对T/S比值），并与DNA印迹法（Southern blot）测得的平均末端限制性片段（TRF）长度作比较。结果MMQPCR方法测定端粒长度相对T/S比值为1.13依0.21，Southern blot方法测量平均TRF长度为（7.46依1.21）kb，两种方法测定结果的相关性分析R2=0.6706（P<0.001）。结论本研究建立的MMQPCR方法测定端粒长度重复性好、省时、简便、可靠，可高通量处理大量样品。

端粒长度；多重定量PCR；T/S比值；末端限制性片段

有研究表明，端粒长度是生物学老化的标志[1]，端粒缩短被认为与多种心脑血管病的发生及进展有关[2-5]。端粒长度的测定方法最早由Harley等[6]在1990年提出，即通过Southern blot测定末端限制性片段（TRF）的长度，该方法虽然过程繁琐，所需DNA量大，但至今仍是端粒长度测量方法的野金标准冶。随后人们提出了定量荧光原位杂交（Q-FISH）[7]和建立流式荧光原位杂交（Flow-FISH）[8]（流式荧光原位杂交）。2002年，Cawthon[9]首创了荧光定量PCR测定端粒相对长度的方法，即通过计算端粒拷贝数（T）与单拷贝基因拷贝数（S）的比值T/S来反映平均端粒长度，但该方法中端粒DNA和单拷贝基因的扩增是在不同的反应管中进行，使得模板起始量的不同对结果的变异产生重要影响，为解决这一问题，2009年，Cawthon[9]还提出了单色多重定量PCR方法（MMQPCR）[10]。该方法对荧光定量PCR仪有一定要求，即能够在一个循环中两次收集SYBR Green荧光信号，而国内外实验室使用较多的ABI系列如7900HT、7700等无此功能。因此，目前研究者仍普遍采用Cawthon[11]于2002年提出的定量PCR方法测定端粒长度。罗氏480（LightCycler480）荧光实时定量PCR仪被广泛应用于诊断和研究，但文献中较少见到其被用于测定端粒长度[11-13]，本文参照Cawthon[9]2009提出的MMQPCR，优化实验中的参数，阐述在罗氏480实时定量PCR仪上建立MMQPCR的过程，并与传统的Southern b lot方法测量平均TRF长度作相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

实验标本选自2013年11月1~30日南京医科大学附属淮安第一医院（以下简称野我院冶）检验科体检者的肘静脉新鲜EDTA抗凝血2 mL，共40例，其中男19例，女21例，年龄38~79岁，平均（61.46依11.58）岁。本研究获得我院医学伦理委员会审查通过，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 单色多重荧光实时定量PCR测定端粒长度使用富士核酸提取系统提取基因组DNA，操作严格按照说明书进行。微量紫外分光光度计测DNA的浓度与纯度，OD260/280为1.7~1.9为合格，记录DNA的浓度。使用TB缓冲液将待测样本DNA浓度稀释至7 ng/滋L，任意选取一样本作为标准品，使用Milli-Q超纯水按1︰2.5的比例将标准品DNA浓度依次等比稀释为45、18、7.2、2.88、1.152 ng/滋L，并放于-20益冰箱保存备用。端粒长度的测定参照Cawthon2009年提出的MMQPCR[7]。反应使用的引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，序列如下院telg 5忆-ACAC-TAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3忆；telc 5忆-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATC-CCTATCCCTAACA-3忆；hbgu 5忆-CGGCGGCGGGCG-GCGCGGGCTGGGCGGCTTCATCCACGTTCACCTTG-3忆；hbgd 5忆-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCG-GAGGAGAAGTCTGCCGTT-3忆。反应体系院SYBR Green玉Master（罗氏公司）7.5滋L，样本DNA 5滋L（待测样本DNA含量为35 ng，标准品含量依次为225、90、36、14.4、5.76 ng），端粒引物telg、telc终浓度均为500 nmol/L；单拷贝基因引物HBGU、HBGD终浓度均为200 nmol/L。反应在同一块384孔板上进行，标准品和待测样本均设置3复孔，另外设置以相同体积的超纯水作为DNA的阴性对照，亦为3个复孔。使用仪器为LightCycler 480实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）。反应条件为玉院95益15 min；域院94益15 s，49益15 s，2个循环；芋院94益15 s，62益10 s，74益15 s，84益10 s，85益15 s，38个循环。反应结束后建立熔解曲线。从LightCycler480v1.5拷出原始数据，使用软件野Conversion from LightCycler480 to Lin-RegPCR冶将其转换并导入LinRegPCR（v12.15）软件进行分析。

1.2.2 Southe rn b l o t测量平均TRF长度实验前进行琼脂糖凝胶电泳检验待测DNA的完整性，使用罗氏试剂盒TeloTAGGG Telomere Length Assay（罗氏公司）完成平均TRF的测定，琼脂糖、尼龙膜亦购于该公司，实验参照试剂盒提供的步骤进行。具体为院限制性内切酶Hinf I和Rsa I酶切基因组DNA（1.2μg，包括试剂盒提供的对照DNA）2 h，将酶切DNA连同地高辛标记的marker放于0.8%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压电泳10 cm，使用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷尼龙膜上，120益烘烤30 min，使用试剂盒提供的杂交液42益预杂交1 h后，用地高辛标记的端粒探针42益杂交3 h，洗膜后，加入显影底液，并将尼龙膜放入LAS-4000数字成像系统中进行连续曝光，曝光时间15~20min，选择曝光强度最适宜的一张照片进行TRF长度测定。使用图像处理软件Image J（v1.44p），根据公式TRF=移（ODi）/移（ODi/Li）计算平均TRF长度。其中，ODi表示位置i的光密度值，Li表示位置i的marker长度，不同批次的结果根据control DNA进行校正。

1.3 观察指标

淤观察PCR产物的熔解曲线、端粒与单拷贝基因的标准曲线；于观察T/S比值的重复性，计算批内变异系数及批间变异系数；盂分析T/S比值与平均TRF长度的相关性。

2 结果

2.1 熔解曲线、标准曲线及相对T/S比值的计算

PCR产物的熔解曲线如图1所示，熔解曲线为两个完全分开的双峰，Tm值分别为78益和91益，分别为端粒扩增产物和单拷贝基因扩增产物。分别计算各个浓度标准品端粒和单拷贝基因的平均Ct值，并以DNA含量的对数值log[DNA]作横坐标，以Ct值作纵坐标，在Microsoft Excel中绘制端粒和单拷贝基因的标准曲线，得出R2值和公式（图2）。从图中可以看出，端粒和单拷贝基因的标准曲线R2均>0.99，且两条标准曲线几乎平行，说明端粒和单拷贝基因扩增效率相近，提示在225~5.76 ng范围内，使用该标准曲线计算待测样本的端粒长度可靠。将各个待测样本的原始Ct值代入公式，进行幂转换，得到每个待测样本相对于标准品的端粒的纳克数（T）和单拷贝基因的纳克数（S），最后计算3个复孔T/S比值的平均值，即得到每个待测样本相对于标准品的T/S比值。

图1 PCR产物熔解曲线

图2 端粒和单拷贝基因的标准曲线

2.2 T/S比值的重复性检验

计算每个待测样本3个复孔T/S比值的变异系数，然后计算39个样本变异系数的几何均数，得出批内变异系数为2.9%。为了检验该MMQPCR方法的批间重复性，同样的39个样本于第2天进行重复测量，仍为3个复孔，且保证每个样本在384孔板上的位置与前一次不同，以减少位置效应。两次独立实验各个样本T/S均值的相关性见图3，可以发现线性回归线的斜率接近于1，且在Y轴上的截距接近于零。计算两次实验每对样本T/S比值的变异系数，最后求得39对样本变异系数的几何均数，即批间变异系数为3.4%。

图3 相同样本两次实验所得T/S均值的相关性

2.3 T/S比值与平均TRF长度的相关性分析

计算39个样本DNA的平均T/S比值为1.13依0.21，平均TRF长度为（7.46依1.21）kb，从图4可以看出两种不同方法测得的结果存在明显相关性（R2= 0.6706，P<0.001）。

图4 相对T/S比值与平均TRF长度的相关性

3 讨论

MMQPCR将端粒和单拷贝基因置于同一个反应管中扩增，利用端粒和单拷贝基因丰度和产物Tm值的差异，使用SYBR Green染料在一个循环中顺序收集端粒荧光信号和单拷贝基因荧光信号。该方法与传统多重PCR不同的是两个目标基因的扩增并不是同时进行。端粒首先扩增并在74益收集信号，由于端粒的丰度远比单拷贝基因高，此时单拷贝基因的Ct值仍在基线水平以下，因此74益的Ct值仅代表端粒。温度继续升高到85益，因为此时端粒产物已完全解链，释放DNA聚合酶用于单拷贝基因的扩增，由于单拷贝基因引物5忆端被加了野GC钳冶，提高了退火温度，使其在85益仍能扩增，因此此时收集的荧光仅代表单拷贝基因产物。该方法与之前的PCR方法比较，试剂和模板用量以及时间均减少了一半，更为重要的是消除了模板起始量不同对结果产生的影响，减少了批内误差。

扩增效率是影响定量PCR可靠性的最重要因素[14]，由于实时定量PCR通过Ct值来计算模板的起始量，因此所有样本的扩增效率一致显得很重要。端粒的定量PCR利用两个基因的扩增来计算端粒长度，其中任何一个都有可能存在效率误差，因而对效率误差尤为敏感。有文献报道了端粒定量PCR可接受的效率范围为95%~103%[16]，但这个范围只是象征性的，如果所有的样本的扩增效率一致，具体的数值并不重要，80%和100%一样可靠，因为导致效率误差的是样本之间扩增效率的差别[15]。另一个与扩增效率有关的问题与标准品有关。端粒定量PCR通过外部标准曲线法计算端粒长度，一般来说应使用任一个待测样本，或多个样本的混合作为标准品。因为在血样本的保存及DNA的提取过程中有很多化学物质可抑制PCR反应，如乙醇、酚、EDTA等[17]，而标准品与待测样本来源相同可以控制抑制因子对PCR的影响，从而减少标准品与待测样本之间的效率误差[15]。相反，使用购买的高度纯化的标准品[18]和来自细胞系的标准品[19-20]则不能消除抑制因子的影响。

本实验在罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪上进行端粒与单拷贝基因的扩增，利用LinRegPCR软件进行数据分析，解决了仪器自带软件无法分析数据的问题，从而拓宽了MMQPCR方法测定端粒长度的应用范围。与传统的Southern blot方法比较，MMQPCR方法具有省时、简便的特点，可高通量处理大量样品。

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Telomere length measurem ent by m onochrom e m ultip lex quantitative PCR m ethod

ZHONG Yun
Department of Geriatrics,Huai忆an First People忆s Hospital,Nanjing Medical University,Jiangsu Province,Huai忆an 223300,China

Ob jective To establish amonochromemultiplex real-time quantitative polymerase chain reaction(MMQPCR), for telomere lengthmeasurementon theRoche LightCycler480(LC480)real-time PCR platform.M ethods Telomere lengths (T/S ratio)weremeasured from 39 DNA samples extracted from human white blood cells using the MMQPCR method on the LC480 platform,and were compared with terminal restriction fragment(TRF)lengthsmeasured by Southern blot. Results Relative T/S ratiomeasured by MMQPCR was 1.13依0.21,and mean TRF length was(7.46依1.21)kb.The cor-relation coefficient(R2)for the relationship of the two differentmethodswas 0.6706(P<0.001).Conclusion The MM-PQPCR method is reproducible,rapid,and simple,thus reliable for a high throughput of samples.

Telomere length;Multiplex quantitative PCR;T/S ratio;Terminal restriction fragment

R34

A

1673-7210（2016）07（a）-0014-04

院2016-03-21本文编辑院任念）

仲韵（1988.10-），女，硕士；研究方向院心脑血管病患者生物标志物研究。