ShRNA靶向沉默STX 8基因对U251细胞增殖和迁移侵袭的影响

杨海峰 杨亮 毕艳华 黄淑红

1.北京市仁和医院神经外科，北京102600；2.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050000；3.华北石油管理局总医院科研教学培训科，河北任丘062550；4.山东大学医学院神经生物学系，山东济南250012

ShRNA靶向沉默STX 8基因对U251细胞增殖和迁移侵袭的影响

杨海峰1杨亮2毕艳华3黄淑红4

1.北京市仁和医院神经外科，北京102600；2.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄050000；3.华北石油管理局总医院科研教学培训科，河北任丘062550；4.山东大学医学院神经生物学系，山东济南250012

目的探讨敲低STX8基因对脑胶质瘤细胞瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法构建STX8-shRNA-pSuper表达载体转染U251细胞，分别用CCK8法、划痕实验、Transwell实验检测细胞增殖、迁移侵袭能力。结果CCK8法、划痕实验、Transwell实验结果显示，STX8干扰后细胞增殖、迁移侵袭能力显著下降。结论STX8基因的敲低能有效抑制U251细胞增殖、迁移侵袭能力，STX8基因有可能成为胶质母细胞瘤基因治疗的新靶点。

STX 8基因；胶质细胞瘤；RNA干扰；U251细胞

脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一，目前临床治疗手段疗效有限[1-2]，需要迫切寻找其关键致癌因子。近年来，研究发现SNARE蛋白在肿瘤发生发展中发挥重要作用，其相关蛋白能否作为肿瘤治疗的分子靶点也受到了很多关注[3-5]。成员之一Syntaxin8（STX8）参与了胶质母细胞瘤的发展[3]。目前尚未有STX8在脑胶质瘤细胞中参与哪些细胞功能的研究，本文通过分析脑胶质瘤细胞株U251中STX8的作用，探讨其在脑胶质瘤中的发生发展和侵袭的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

pSuper院OligoEngine公司，STX8抗体院BD Bio-sciences公司，茁-tubulin抗体院Sigma公司，HEK293细胞为实验室保存，U251细胞系院中科院上海细胞库。

1.2 载体构建及筛选

将干扰序列溶解至3μg/滋L，取正反oligo各1滋L，溶于48滋L退火buffer。靶序列院1#GACCGAAGACA-GAACCTCTTGCTC；2#ATACGATTCTACTTGT-

CAAATCTC。退火产物及载体（pSuper）酶切、连接、转化、测序。使用测序成功的2个pSuper-STX8干扰质粒（1#，2#）分别转染HEK293细胞，为pSuper-STX8干扰组。空载体作为阴性对照。

1.3 RT-PCR

收集pSuper-STX8干扰组和阴性对照组细胞提RNA，反转录cDNA。STX8引物F院5ˊ-GAGGAGCCA-GAGGAGACCAG-3ˊ，R院5ˊ-TAGAGGAAAGGGCAT-CAAGG-3ˊ；内参GAPDH引物F院5ˊ-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3ˊ，R院5ˊ-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3ˊ。反应体系院模板cDNA 2滋L，2伊SYBRPremix Ex TaqTM域10滋L，引物（F+R）0.8滋L+ 0.8滋L，ddH2O 6.4滋L。反应条件院95益预变性5min，95益变性15 s，60益退火延伸30 s，40个循环。重复3次，2-驻驻Ct分析法进行分析。

1.4 W estern blot

转染48 h后收集pSuper-STX8干扰组和阴性对照组细胞提取蛋白BCA法测定浓度。剩余蛋白进行电泳，SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗（1︰1000），4益孵育过夜，加二抗（1︰5000），孵育1h，电化学发光法（ECL）显色。采用Image J分析图像，以STX8/茁-tubulin灰度比值表示STX8蛋白的相对表达水平。

1.5 CCK8实验

电转U251细胞，转染24 h后取pSuper-STX8干扰组和阴性对照组细胞制备悬液接种。接种后第24、48、72小时加CCK8溶液，混匀后培养2 h，酶标仪测OD450nm值。

1.6 划痕实验

将电转24 h后的U251细胞（pSuper-STX8干扰组和阴性对照组）接种于6孔板培养过夜，在孔中部划一个区域，确保每组划伤区域一致，PBS漂洗，加入无FBS培养基。每隔24 h拍照。

1.7 Transwell实验

Transwell小室铺胶，下室加无血清培养基；电转U251细胞（pSuper-STX8干扰组和阴性对照组）24 h后饥饿培养12 h，制备细胞悬液；24孔板中加完全培养基，上室加200滋L细胞悬液，培养24 h；4%多聚甲醛固定小室底面，0.1%结晶紫染液染色；切下小室基底膜，计数穿过的细胞。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数依标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STX8的敲低效率

RT-PCR结果显示，2#质粒干扰组STX8的mR-NA表达量是阴性对照组的（17.5依5.35）%，抑制率达（82.5依5.35）%两组STX8mRNA表达量比较，差异有高度统计学意义（P<0.01），起到有效的抑制作用，见图1A。Western blot结果显示，2#质粒干扰组的STX8蛋白表达量只有对照组的19.5%，两组比较差异有统计学意义（P<0.01），见图1B。后续实验采用2#质粒。

2.2 CCK8法检测U 251细胞增殖能力

结果显示，培养48 h时，pSuper-STX8干扰组细胞的OD值（0.929依0.0485）显著低于阴性对照组（1.191依0.0581），差异有统计学意义（P<0.05）；培养72 h时，pSuper-STX8干扰组细胞的OD值（1.194依0.0615）依然显著低于阴性对照组（1.490依0.074），差异有统计学意义（P<0.05），提示STX8的敲低显著降低了U251细胞的增殖。见图2。

图2 STX8 shRNA抑制U251细胞增殖能力

2.3 划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力

在划痕实验中，48 h后阴性对照组细胞迁移覆盖大部分划痕区，而pSuper-STX8干扰组细胞向划痕区移动距离较小，划痕区依然明显存在（图3），提示STX8敲低能明显抑制U251细胞的迁移能力。在Transwell实验中，STX8 shRNA干扰组细胞穿膜细胞数[（87依8）个]显著低于阴性对照组[（46依5）个]，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

图3 STX8 shRNA抑制U251细胞迁移能力

图4 STX8 shRNA抑制U251细胞侵袭能力

3 讨论

SNARE蛋白介导分泌囊泡与质膜的锚定、融合，是真核细胞中调节膜融合的关键因子，参与许多细胞功能[6-7]，如细胞自噬[8-9]。其成员STX8参与细胞内物质运输和膜融合过程[10]；STX8蛋白可以与STX7、Vti1b、VAMP7或VAMP8蛋白形成复合体，启动囊泡融合促进蛋白降解[11]；STX8蛋白还参与Ca2+、K+离子通道和受体TrkA的胞内运输过程[12-15]，与2型糖尿病相关[16]。

SNARE蛋白在肿瘤发生发展中发挥重要作用，STX6参与了食管癌的发生发展[17-18]，研究发现多形性胶质母细胞瘤中STX8结合MIG-6蛋白形成复合体，促进表皮生长因子受体从早期内体进入晚期内体并启动降解[19]。表皮生长因子受体在人脑恶性胶质瘤中会发生扩增、重排、突变和过度表达等变化，导致细胞失控和转化[20]。但STX8具体参与到哪些细胞功能调控的研究尚无相关的报道。

本实验通过构建特异性敲低STX8的shRNA载体，检测STX8功能缺失对脑胶质瘤细胞的影响。CCK8结果显示，STX8的敲低显著降低了U251细胞的增殖速度；划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示，STX8 shRNA能明显抑制U251细胞的迁移侵袭能力。因此，STX8的敲低会显著影响细胞增殖、迁移侵袭能力。

综上所述，脑胶质瘤细胞中的STX8基因可能参与了多种细胞功能的调控，在未来脑胶质瘤的基因治疗中可以作为潜在靶点。但STX8在脑胶质瘤发生发展中的具体机制还有待研究。

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Effect of ShRNA targeted silencing of STX8 gene on p roliferation and m igration of U251 cells

YANGHaifeng1YANG Liang2BIYanhua3HUANG Shuhong4
1.Department of Neurosurgery,Beijing Renhe Hospital,Beijing 102600,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Research Teaching and Training Section,General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau,Hebei Province, Renqiu 062550,China;4.Department of Neurobiology,Medical Academy of Shandong University,Shandong Province, Ji'nan 250012,China

Objective To study the effect of knockdown STX8 gene on proliferation and migration of U251 cells.Methods STX8-shRNA-pSuper expression vector,transfected U251 cells were constructed,cell proliferation,migration and invasion ability were determined by CCK8 test,scratch test and transwell assay respectively.Results The cell prolifer-ation,migration and invasion ability of STX8 interference group was significantly decreased.Conclusion Knockdown of STX8 inhibits the proliferation,migration and invasion ability of U251 cells,STX8 genemay be a new target for gene therapy of glioblastoma.

STX8 gene;Glioma;RNA interference;U251 cell

R739.41

A

1673-7210（2016）07（a）-0004-04

2016-04-03本文编辑：任念）

国家自然科学基金资助项目（31271519）。

毕艳华（1977.11-），女，副主任医师，主要从事神经外科危重症及肿瘤精准治疗研究；黄淑红（1978.6-），女，副教授；研究方向院分子神经生物学。