氯沙坦减轻梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化及肾小管上皮细胞凋亡机制的研究

何平，闵柳畅，张蓓茹，杨旭，苏晓晓，李德天

（中国医科大学附属盛京医院肾内科，沈阳 110004）

·论著·

氯沙坦减轻梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化及肾小管上皮细胞凋亡机制的研究

何平，闵柳畅，张蓓茹，杨旭，苏晓晓，李德天

（中国医科大学附属盛京医院肾内科，沈阳 110004）

目的 探讨氯沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾小管上皮细胞凋亡和肾间质纤维化的影响及其可能机制。方法通过结扎并离断大鼠单侧输尿管制作梗阻性肾病模型，对照组进行假手术。留取术后第3，5，7及14天肾脏组织及血尿标本。结果 单侧输尿管梗阻使α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达水平明显增加，并导致肾小管间质纤维化和肾组织细胞凋亡明显增加。肾间质纤维化的进展伴随着STAT3的磷酸化和2种凋亡相关蛋白（Bax和Bcl-2）的表达改变。氯沙坦干预治疗可以减少这些变化。结论 在单侧输尿管梗阻的大鼠模型中，氯沙坦能缓解肾脏纤维化及肾小管细胞的凋亡程度。这种疗效可能是通过部分阻滞STAT3信号通路完成的。

肾间质纤维化；细胞凋亡；氯沙坦；STAT3信号通路；凋亡相关蛋白

肾小管间质纤维化是终末期肾病的共有阶段，特点是肾脏成纤维细胞的增生与异常激活［1～4］。上尿路梗阻对肾脏的影响巨大，并且是儿童及成年人肾功能不全的一个重要原因［5］。即使及时的手术治疗尿道梗阻仍然可能有不可逆的肾单位损伤。肾素血管紧张素醛固酮系统的抑制剂是否可以减轻肾间质的纤维化及肾小管上皮细胞的凋亡仍有争议。本研究的目的在于评估梗阻性肾病大鼠模型中氯沙坦对肾纤维化进展及肾小管细胞凋亡的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 单侧输尿管梗阻模型制作和氯沙坦治疗

饲养在盛京医院实验中心的健康成年雄性大鼠，在恒温、相同光照下（光照周期为7时至18时），食物和水随机提供。通过中线切口暴露腹腔，分离左侧输尿管并结扎离断。动物实验分为2部分。第1部分实验分为5组。对照组（Sham组）的动物用同样的手术步骤但不结扎输尿管。另外4组（统称模型组）大鼠分别在结扎输尿管后的第3，5，7，14天被处死（分别为UUO3 d组，UUO5 d组，UUO7 d组和UUO14 d组）。第2部分实验分为4组。对照组（Sham组），Sham+氯沙坦组，UUO7 d组，UUO7 d+氯沙坦组。氯沙坦溶解在水中通过灌胃法给予大鼠［4］。实验结束时，所有大鼠麻醉后留取肾脏做免疫印迹分析或者组织学检查。

1.2 肾脏的形态学观察

标本固定后脱水，石蜡包埋，切片（4 μm），马松三色染色后，光镜下观察肾脏形态。蓝色颗粒和线性沉淀为胶原蛋白染色阳性。染色结果采用计算机图像定量分析。

1.3 免疫印迹分析

组织样本等量上样。凝胶电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上。封闭后，分别加入STAT3、p-STAT3一抗（1∶1 000稀释，Cell Signaling公司）、Bcl-2（1∶500稀释，Santa Cruz公司）、Bax（1∶500稀释，Santa Cruz公司）、α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白（1∶1 000稀释，Sigma公司）4℃摇床孵育过夜。加入相应二抗，进行ECL反应。一次性完成定影、显形、图像分析系统测定条带的灰度值。

1.4 TUNEL检测

图1 模型组肾脏α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达Fig.1 Effect of UUO on the expression levels of renal typeⅠcollagen and α-SMA in the kidneys of rats subjected to UUO

肾组织石蜡切片厚约3 μm，按试剂盒所示步骤进行操作。凋亡细胞数计数：每张切片随即选10个高倍视野（×400），分别检测每个高倍视野内TUNEL阳性细胞数，求出平均每个高倍镜视野内阳性细胞数，比较其均值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 单侧输尿管梗阻导致肾脏细胞凋亡及α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达增加

Sham组大鼠肾脏的α-SMA表达水平可忽略不计。在模型组的表达水平明显增加，第3天是Sham组的3倍，第14天是Sham组的9倍，见图1。Ⅰ型胶原蛋白的表达水平也呈时间依赖性递增的趋势。Sham组肾脏无细胞凋亡。单侧输尿管梗阻3 d与Sham组相比，凋亡细胞数明显增多。TUNEL染色阳性细胞数随着梗阻时间的增长而持续增加，见图2。

图2 单例输尿管梗阻导致肾脏细胞凋亡 ×400Fig.2 UUO lead to renal cell apoptosis×400

2.2 氯沙坦抑制梗阻性肾病STAT3的磷酸化

图3 模型组肾脏STAT3的磷酸化水平Fig.3 Effect of UUO on the phosphorylation levels of STAT3

模型组肾脏中STAT3的磷酸化水平随着时间的增加而提高，见图3。其磷酸化水平在第14天的时候是对照组的9倍。氯沙坦的干预治疗在第7天很大程度上降低了STAT3的磷酸化水平，见图4。

图4 氯沙坦干预后STAT3的磷酸化水平Fig.4 Effect of losartan on the expression and phosphorylation levels of STAT3 following UUO

2.3 氯沙坦抑制肾间质纤维化的发展

图5 氧沙坦抑制肾间质纤维化的发展 ×400Fig.5 Effect of losartan on renal fibrosis×400

Masson染色（图5）显示，第7天的单侧输尿管梗阻的肾脏与Sham组相比间质纤维化水平明显增加。氯沙坦的治疗显著降低了纤维化水平。定量分析显示，Sham组的肾间质纤维化体积为（1.5± 0.5）%，模型组的肾间质纤维化体积为（15.7±3.2）%，氯沙坦干预后肾间质纤维化体积减少为（10.1± 1.8）%。α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达水平也被氯沙坦部分抑制，见图6。

2.4 氯沙坦抑制梗阻性肾病肾小管细胞的凋亡和凋亡蛋白的表达

氯沙坦的应用能部分减轻肾小管上皮细胞凋亡，见图7。同Sham组相比，梗阻7 d后Bax的表达水平明显增高，Bcl-2的表达水平有所下降。应用氯沙坦干预治疗后，Bax的表达水平较前下降，Bcl-2的表达水平有所上升，见图8。

图6 氯沙坦抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达Fig.6 Effect of losartan on the expression levels of α-SMA and typeⅠcollagen

图7 氯沙坦抑制梗阻性肾病肾小管细胞凋亡 ×400Fig.7 Effect of losartan on the levels of renal tubular cell apoptosis×400

图8 氯沙坦抑制梗阻性肾病凋亡蛋白Bax，Bcl-2的表达Fig.8 Effect of losartan on the levels of Bax，Bcl-2

3 讨论

本研究结果表明，氯沙坦能抑制输尿管梗阻肾脏肾纤维化的增加，并减少细胞外基质的沉积和Ⅰ型胶原蛋白的表达。之前的研究表明，α-SMA激活的肌纤维母细胞是主要的效应细胞，是纤维化肾脏中细胞外基质沉积的原因。本研究的数据表明，应用氯沙坦能减轻单侧输尿管梗阻性肾病肾间质纤维化和α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白的表达水平。肾间质纤维化的进展是一个复杂的过程，与多种细胞的信号通路和分子因素有关［6］。本研究表明，在梗阻后的第3天，STAT3蛋白的磷酸化明显增加，直到第14天达到顶峰。说明STAT3的磷酸化在介导肾间质成纤维细胞的活化和肾间质纤维化的进展中的重要性。数据还清楚地表明了氯沙坦干预治疗能部分减弱STAT3信号通路活化及单侧输尿管梗阻造成的肾间质纤维化。本研究也表明，与Sham组大鼠的肾脏相比，在单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤的肾脏中Bax/Bcl-2的比率（促凋亡信号）增高，肾脏组织凋亡细胞明显增加。

本研究证实了Manucha等［7］的研究结果，其研究结果表明在梗阻性肾病的大鼠模型中，氯沙坦有减少Fas配体的表达水平及抗细胞凋亡的疗效。本研究的细胞凋亡结果也由氯沙坦对STAT3信号通路的影响证实。

慢性肾脏病的发病率和患病率在世界范围内不断增加，其治疗的主要目的是防止或减缓疾病的进展［8］。本研究结果提供了血管紧张素受体拮抗剂在减缓慢性肾脏病进展中作用的证据。结果表明在单侧输尿管梗阻的大鼠模型中氯沙坦能有效地减慢肾间质纤维化和细胞凋亡的水平。氯沙坦的抗纤维化作用及抗凋亡与STAT3信号通路的抑制有关。

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（编辑 于 溪）

Mechanism ofLosartan on RenalInterstitialFibrosisand RenalTubular EpithelialCellApoptosisin Ratswith Obstructive Nephropathy

HE Ping，MINLiu-chang，ZHANGBei-ru，YANGXu，SUXiao-xiao，LIDe-tian
（DepartmentofNephrology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of losartan on renal tubular cell apoptosis and renal fibrosis in a rat model of UUO，and explore the related mechanism.Methods Rats were subjected to UUO by ureteral ligation and treated with dimethyl sulfoxide（control）or losartan.Controls were given sham operations.Renaltissues were collected 3，5，7，and 14 days aftersurgery formeasurementofvarious indicators ofrenalfibrosis.Re⁃sults UUO increased the expression ofα-SMA and collagenⅠ，and improved the extentofrenaltubularfibrosis and apoptosis in a time-dependent manner.Losartan treatment partially reversed these effects.Progression of renal interstitial fibrosis was accompanied by phosphorylation of signal transducerand activatoroftranscription 3（STAT3）and altered expression oftwo-apoptosis-related proteins（Bax and Bcl-2）.Losartan treatmentalso partially reversed these effects.Conclusion Our results indicate that losartan attenuates renal fibrosis and renal tubular cell apoptosis in a rat modelofUUO.Thiseffectappears to be mediated by partialblockage ofSTAT3 phosphorylation.

renal interstitial fibrosis；cell apoptosis；losartan；STAT3 signal pathway；apoptosis-related proteins

R695.1

A

0258-4646（2016）02-0136-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.009

辽宁省教育厅科学研究项目（L2013295）；辽宁省博士科研启动基金（201501005）

何平（1978-），女，副教授，博士.

李德天，E-mail：lidetian@sj-hospital.org

2015-05-05

网络出版时间：