阵列单液滴的捕获及单细胞分析

吴 婷, 王振平, 张传静, 杜一平

(华东理工大学分析测试中心,上海 200237)



阵列单液滴的捕获及单细胞分析

吴 婷, 王振平, 张传静, 杜一平

(华东理工大学分析测试中心,上海 200237)

通过流动聚焦型微液滴生成装置进行油包水液滴的制备,比较了3种不同的单液滴阵列捕获芯片对单液滴的捕获效率和操作性能,选取上下开口圆形结构获得满意的单液滴捕获。进一步利用该液滴生成和捕获一体式芯片进行了液滴中单细胞的包覆、单细胞的实时染色和细胞存活状态的检测。在优化的实验条件下制备得到了粒径为75 μm的单分散液滴,液滴捕获芯片中的单液滴截留率为100%,单细胞包覆率约为33%。对捕获液滴中的单细胞进行实时染色结果表明,在5 min内获得了满意的细胞核实时染色,并通过细胞死活实时染色对细胞存活状态直接进行了表征。

微液滴; 单液滴阵列; 单细胞

微流控芯片技术是近年来发展非常迅速的一个交叉学科的研究方向。它将通道尺寸在10～100 μm的通道网络集成在一个芯片中,可以在芯片中进行极小样品体积的引入、混合和反应,并通过多种检测方式获取有用的信息。微液滴芯片技术作为微流控芯片技术的一个重要分支,在化学、生物、材料科学、药学等领域已经发挥了非常重要的作用[1-5]。在微液滴芯片中,单分散的液滴会以每秒数千计的速率源源不断地产生,每个液滴即成为一个单独的封闭反应腔体,在这样的微液滴中可以进行如化学物检测[5-6]、化学合成[7-8]、酶活检测[9-10]、基因表达[11-12]、细胞相关实验[13-14]等诸多实验。同时,在微液滴芯片中还可以进行包括液滴融合、分裂、分选等多步操作,这些优势使其成为化学和生物学中非常有用的技术平台。

阵列相关技术在药物开发、微生物学和细胞生物学中被广泛采用[15]。在阵列中整齐排列的众多单元允许进行平行的过程,利用较少的液体就能同时监测多个化学或生物反应。这样不仅能极大地减少样品的体积,而且可以增加分析的通量,获得统计学分析的信息。现有的获取细胞统计学信息分析的方法主要是使用流式细胞术对荧光染色的细胞得到统计学信息。然而由于流式细胞术为连续流中进行的检测,细胞间并无扩散界限,因而无法根据其分泌的特征物质进行实验或分选,只能根据其胞内物质或细胞膜表面的物质来进行分析。将微液滴芯片与阵列技术结合,生成的液滴通过一个阵列结构进行捕获,单个液滴即为一个独立的反应体系,利用单液滴阵列能进行极小体积内的各类平行实验。其中阵列微液滴芯片中的单细胞分析就是热门方向之一[16-17]。单细胞分析是分析化学、生物学和医学之间渗透发展形成的跨学科前沿领域。常规的细胞分析所获得的是大量细胞的平均值,然而由于细胞间的差异性,这样的结果常常会误导大家。譬如一个细胞群体中50%的蛋白表达可能是一半细胞的100%表达,亦可能是所有细胞均有50%的表达。单细胞分析可以获得大量个体细胞的信息以及统计学有用的数据。在微液滴中包覆单细胞可以平行检测细胞的组分,实时监测细胞释放及高通量阵列检测等。

本实验中将微液滴生成和捕获设计在同一芯片中,将生成的微液滴直接流入单液滴捕获结构中被捕获,而单细胞被包覆在液滴中,从而可以直接观察液滴中单细胞的实时染色情况,并获得细胞存活率信息。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)Sylgard184 购于美国道康宁公司(DOW CORNING,USA);山梨醇酐单油酸酯(Sorbitan monooleate,Span-80)分析纯,购于国药集团化学试剂公司;正十六烷(n-Hexadecane)，分析纯,购于上海凌峰化学试剂有限公司;DAPI、钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)均购于东仁化学科技有限公司。

1.2 微流控芯片制作

芯片的制作均采用标准的软刻蚀(Soft Lithography)法(SU-8模具和PDMS复制)。首先将设计好的芯片结构制成透明的光刻掩膜,将负光刻胶SU-8 2050 旋涂于硅片上制成厚度为100 μm的一层,通过紫外灯曝光将掩膜上的图形转移至光刻胶上后显影成所需的芯片模板。将PDMS与固化剂按体积比10∶1混合均匀,真空脱气后浇筑于SU-8模板上,在干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中65 ℃热烘2 h。PDMS复制片从硅片上剥离后通过氧气等离子体(PDS-001 等离子体清洗机,Harrick,美国)的作用与载玻片键合,完成芯片的封装。聚四氟乙烯管(内径为0.9 mm)用于连接注射泵和芯片通道。芯片中液体的流速通过注射泵(保定兰格恒流泵有限公司)控制。

芯片的示意图如图1所示。其中液滴生成部分采用的是流动聚焦型微液滴生成装置,通道宽度为 100 μm,高度为100 μm,狭口处宽度为50 μm。液滴捕获装置含有127个捕获单元。液滴生成部分A和液滴捕获部分B通过连续相直接引入的方式进行连接。

图1 液滴形成与捕获一体式芯片结构图Fig.1 A schematic of chip structure for droplet formation and encapsulation

1.3 液滴的生成和成像

本文中液体的驱动全部通过注射泵完成,装置如图2所示,包含w=3%的Span 80稳定剂的正十六烷充当体系的连续油相。所有的液体均经过0.22 μm滤膜过滤后进入微流控芯片中。液滴的生成通过一个含有两个入口的流动聚焦型芯片来实现。

图2 液滴生成、捕获和观测装置图Fig.2 Device for droplets formation, encapsulation and observation

液滴的生成和捕获阵列中的液滴均通过激光共聚焦显微镜(Nikon,A1R)来成像显示,所使用物镜放大倍数为10,成像软件为NIS Elements。

1.4 细胞培养和染色液的配制

卵巢癌细胞skov3细胞株(中科院细胞库提供)在RPMI-1640培养液(灭活胎100 mL/L牛血清,100 ku/L青霉素,50 g/L链霉素)中培养,并置于CO2培养箱中(37 ℃,φ=5%的CO2,饱和湿度条件)。细胞隔天换液,取对数生长期的细胞用于实验。将贴壁培养的细胞用胰蛋白酶消化,并用磷酸缓冲液(PBS)清洗至少一次,重新悬浮于新鲜的PBS溶液中用于单细胞包覆实验。在单细胞分析实验中,将清洗后的细胞和染色液直接混合进入微液滴芯片中。

将由商业途径获得的DAPI标准液(5 mg/mL)用PBS稀释1 000倍用于后续的细胞染色。

将钙黄绿素AM和PI用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成1 nmol /L的储存液。染色前将储存液用PBS稀释500倍用于后续细胞死活的染色分析。

2 结果与讨论

2.1 微液滴的生成

微液滴的生成通过一个流动聚焦型结构所获得,该结构主要由连续相通道、分散相通道、夹口、主通道组成,微液滴生成后经主通道进入捕获结构(图3(a))。利用该流动聚焦型微液滴生成装置能很好地调控微液滴的粒径。在我们的前期工作[18]中,能通过两相流速的调节来调控微液滴的粒径,在本实验中所采用的是含有50 μm夹口的流动聚焦型芯片,通过控制两相的流速能稳定获得直径为50～100 μm之间的微液滴。考虑到后续的微液滴捕获,控制水相流速为1 μL/min,油相流速为 1.2 μL/min,能稳定获得单分散的微液滴,并且所获微液滴的分布如图3(a)所示,从图中可以看出液滴大小均匀。图3(b)为液滴的直径分布图,该条件下获得的微液滴直径在70～80 μm之间,其中直径在75 μm的液滴约85%左右。

图3 流动聚焦型装置液滴生成的实时图像(a)和微液滴的直径分布图(b)Fig.3 Real time image of microdroplet production (a) and sizes distribution of microdroplets from flow-focusing microfluidic chip (b)

2.2 微液滴的捕获

芯片的另一个组成部分是单液滴捕获装置。其中的液滴捕获结构以能容纳最大直径100 μm液滴为标准,分别考察了3种不同的液滴捕获结构(如图4所示),其中图4(a)和图4(b)所示为两种常用的微球或液滴捕获结构,图4(c)所示为改进后的一种液滴捕获结构。图4(a)所示为上下开口的敞开式三角结构；图4(b)所示为左右开口的圆形结构；图4(c)所示为上下开口的圆形结构,上开口用于液滴的引入,下开口用于液滴的反方向吹离。

图4 3种液滴捕获结构示意图Fig.4 Schematic of three encapsulation structures for microdroplets

图4(a)中的捕获单元类似凹形腔体,两端开口,一端用于接收液滴,另一端作为疏流口。捕获单元交叉排列,使液滴易于被捕获。当凹形结构捕获到液滴以后,后面的疏流口被堵住,流阻变大,其他液滴改道,很难再进入。然而此种结构捕获的液滴容易受两相流速的影响,停泵以后液滴易脱离捕获结构,液滴不能长时间被固定。图4(b)中捕获单元为圆形腔,腔体的两个开口处分别在流体的左右两侧。此种结构两相液体流速不能太大,流速过大会使捕获的液滴从圆形装置小开口一端流走,产生大量小液滴,扰乱后面捕获单元的捕获。基于以上两种结构的特点,经过改进获得了第3种捕获结构(图4(c)),其中捕获单元的圆形腔结构和图4(b)相同,改进腔体的开口端为上下开口,有效地改善了因左右开口流阻不均引起的液滴分裂。借鉴图4(a)中的两列捕获单元错开排列,使液滴易于被捕获。当半圆形结构捕获到液滴以后,后面的疏流口被堵住,流阻变大,其他液滴改道,很难再进入。在液滴进入捕获阵列结构时,开口变大,液体流速变慢,液滴被捕获以后不容易从圆形装置中冲出。当实验结束时,可以通过反向通入油相的方法将液滴推离捕获结构而重新获得空白结构用于下一轮实验。基于以上优点,选择图4(c)的结构进行后续的微液滴的捕获和单细胞分析实验。

图5所示为第3种结构(图4(c))捕获液滴后的照片。从图中可以看出,在水相流速1 μL/min,油相流速 1.2 μL/min时,粒径约75 μm的液滴在捕获结构中均能被捕获,截留单液滴捕获率达到100%。

2.3 液滴中单细胞的包覆

由于所捕获液滴的均一性和稳定性,我们将前述的液滴生成和捕获一体式结构应用于单细胞分析中。每个微液滴中所含的液体体积基本一致,所处的环境一致,一个液滴即为一个单独的反应体系。监测其中的每一个液滴中的单细胞反应,可以获得每个有个体差异的细胞的不同状态,获得单细胞分析的数据,并通过对许多单细胞的分析获得统计学的数据,为后续研究细胞的行为、药物的作用等提供依据。在微液滴生成时包覆单细胞和反应液,可以在微液滴中进行单细胞的一系列分析。采用细胞密度为1.47×106/mL 的卵巢癌细胞(skov3),在水相流速为1 μL/min,油相流速为 1.2 μL/min时,获得33%的单细胞包覆率(图6)。该结果符合泊松分布(Poisson distribution),和文献数据基本吻合[19]。

图5 单液滴的捕获Fig.5 Encapsulation of single droplet

2.4 液滴内单细胞分析

通过该芯片可以获得一定数量的包覆单细胞的液滴。通过在液滴生成过程中的水相入口中通入一定浓度的细胞核染色液DAPI,对细胞核的染色过程进行实时观测。选取其中一个含有单细胞的液滴在共聚焦显微镜下实时采集荧光图像,结果如图7所示。从图中可以看出,2 min以后细胞核已经染上荧光,5 min后荧光达到稳定。

图6 液滴中的单细胞包覆(其中箭头所指为单细胞)Fig.6 Encapsulation of single cell in microdroplets (Arrows for single cells)

通过对液滴中的单细胞进行实时死活的染色,对液滴中的单细胞进行了存活率和存活时间的分析。钙黄绿素和PI两种染料配成一定浓度的溶液可以分别染活细胞和死细胞,在共聚焦荧光显微镜下活细胞呈现绿色,死细胞呈红色。图8(a)所示为芯片外skov3细胞的染色情况,绝大多数细胞都是绿色,说明细胞存活状态良好,只有个别细胞死亡,呈现红色。细胞在悬浮液中分布,拍照时不在同一焦面,颜色亮暗会有差异,与细胞存活状态无关。将钙黄绿素和PI两种染料配成的溶液在液滴生成部分的一个水相入口通入芯片中和单细胞包覆在同一个液滴中,实时观察细胞的状态。如图8(b)所示,5 min后细胞已有明显的荧光,且镜头下拍到的5个细胞均呈绿色,说明被捕获液滴中的细胞为活细胞。经过约60 min的孵育后,细胞存活率未有明显的下降,可见该装置可以实现短时间内对细胞的实时培养和监测。

图7 液滴内对细胞核实时染色Fig.7 DAPI staining in situ in microdroplet

图8 细胞死活染色图像Fig.8 Live-dead staining

3 结 论

本文利用微液滴生成和捕获一体式芯片,能将生成的单分散的微液滴捕获在设计好的截留结构中,很好地实现单液滴的捕获。同时,利用该芯片进行了液滴中单细胞的包覆和分析,在稳定获得包覆单细胞的液滴后,在液滴中可以实时地进行细胞的染色和存活率的分析。该芯片在药物筛选、DNA、蛋白、细胞包覆等方面具有重要的意义和潜在的应用优势。

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Encapsulation of Monodisperse Microdroplet Arrays and Single-Cell Analysis

WU Ting, WANG Zhen-ping, ZHANG Chuan-jing, DU Yi-ping

(Research Centre of Analysis and Test,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

The monodisperse water-in-oil microdroplets were prepared by a flow-focusing microfluidic chip.The capture effciency and operating performame of three different encapsulation structures were compared.A circular structure with opening up and down was selected for better encapsulation of microdroplet.Further,single cell encapsulation in microdroplet,cell staining and cell viability were carried out using this chip.Under the optimum conditions,monodisperse microdroplets with radius of 75 μm were prepared,the encapsulation of microdroplet in chip and single cell in each droplet were 100% and 33%,respectively.Also,staining results of single cell in capture droplets showed that the cell nucleus staining in microdroplets was accomplished within 5 min cell.The viability of cells in droplets was evaluated directly via live-dead staining in real time.

microdroplets; monodroplet arrays; single cell

1006-3080(2016)05-0670-06

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.05.013

2015-12-25

国家自然科学基金青年基金(21205041)

吴 婷(1980-),女,湖南益阳人,博士,研究方向为微流控芯片。E-mail:wu_ting@ecust.edu.cn

杜一平,E-mail:yipingdu@ecust.edu.cn

TQ223.16+2

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