稀有放线菌的选择性分离、鉴定及生物活性研究

 刘　最，李玉中，林慧敏，宋瑞洪 

（衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南　衡阳 421008）

稀有放线菌的选择性分离、鉴定及生物活性研究

刘最，李玉中，林慧敏，宋瑞洪

（衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南衡阳 421008）

聚乳酸（PLA）和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源可以有效提高稀有放线菌的分离效率，同时海洋环境中蕴藏着丰富的活性稀有放线菌，是发现新药的有效途径。为了筛选并鉴定海洋环境中产生活性物质的稀有放线菌，以聚乳酸和丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源，配制6种分离培养基，用平板稀释法分离放线菌；并用滤纸片法和MTT法对供测菌株发酵产物进行活性筛选。结果表明：共分离出96株稀有放线菌，分属于11个属；其中，80株菌对7种靶标菌显示出一定的抗菌活性；78株菌对肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性。另外，比较了6种培养基对稀有放线菌的分离效果。从分离结果来看，最理想的是聚乳酸培养基。

稀有放线菌；选择分离；聚乳酸（PLA）；丝蛋白粉；活性筛选

天然产物是生物活性物质、新化学结构、开发合成及半合成药物使用的先导化合物的重要来源[1]。它种类繁多，主要涵盖微生物、动物及植物领域。其中，微生物领域是寻找新型天然产物的巨大宝库，而开发天然产物的关键在于研究菌株能否产生多种结构新颖的化合物[2]。放线菌是一类重要的微生物资源，目前产生的两万余种活性天然产物中[3]，有一半以上产生于放线菌[4]，包括各种抗生素[5]、酶类[6]、免疫抑制剂[7]及各种抗菌抗肿瘤物质[8]等。这些天然产物多数来自于链霉菌属，并且筛选重复率日益增高，因此研究者们逐渐将目光转向稀有放线菌。碳、氮源是培养基的基本成分，不同类型放线菌可利用的碳、氮源也不同，所以对于稀有放线菌的分离要采用不同于常规的分离方法[3]。

聚乳酸Poly-L-lactic Acid （PLA）也称为聚丙交酯，单体是乳酸，具有良好的耐热性、透明度、机械性能等，被认为是最理想的可降解绿色高分子材料[9-12]。目前，筛选出的可降解聚乳酸的微生物主要是Pseudonocardiaceae家族以及相关菌属[13-15]。明胶作为其诱导物，在一定程度上能加速PLA的降解。丝蛋白粉作为PLA的类似物，能有效诱导聚乳酸降解酶的产生，同时丝蛋白粉在一定程度上也能被放线菌生物降解[15]。

研究选取聚乳酸、丝蛋白粉分别作为选择性碳、氮源来分离放线菌，并对分离菌株进行16SrRNA基因序列分析。此外，还对分离菌株进行活性筛选，以期为开发新型微生物药物提供材料。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土样来源土样来源具体情况见表1。将采集的土样置于4℃冰箱保存备用。

1.1.2指示菌和肿瘤细胞株指示菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、白色假丝酵母（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）。肿瘤细胞株：人子宫颈癌HeLa细胞和人肝癌HepG2细胞。

表1　土样来源

1.1.3主要试剂和仪器主要试剂有：溶菌酶（上海生工公司），蛋白酶K（上海生工公司），其他生化试剂均为国产分析纯。主要仪器有：Taq DNA 聚合酶（Takara 公司），PCR所用引物由上海生工公司合成，PCR扩增仪（BioRad 公司），电泳仪（6003EN，北京六一仪器厂）。

1.1.4培养基分离基础培养基：酵母提取物 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，（NH4）2SO41 g/L，CaCl2·2H2O 0.02 g/L，NaCl 0.1 g/L，K2HPO41.6 g/L，KH2PO40.2 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.000 5 g/L，Na2WO40.000 5 g/L，MnSO40.000 5 g/L，琼脂20 g/L，海水1 000 mL，pH值7.2～7.4[16]。聚乳酸培养基：聚乳酸 2 g/L+分离基础培养基。聚乳酸+明胶培养基：聚乳酸 1 g/L+明胶1 g/L+分离基础培养基。聚乳酸+丝素粉培养基：聚乳酸 1 g/L+丝素粉1 g/L+分离基础培养基。聚乳酸+丝肽粉培养基：聚乳酸 1 g/L+丝肽粉1 g/L+分离基础培养基。丝素粉培养基：丝素粉2 g/L+分离基础培养基。丝肽粉培养基：丝肽粉2 g/L+分离基础培养基。发酵培养基：豆饼粉 25 g/L，淀粉40 g/L，葡萄糖 5 g/L，酵母提取物5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，CaCO31 g/L，50%自来水+50%海水，pH值 7.2～7.4。

1.2试验方法

1.2.1放线菌选择性分离称取样品1 g加至装有9 mL无菌水与小玻珠的无菌离心管中，28℃摇床，转速220 r/min，充分振荡30 min后，将样品依次稀释到10-2和10-3的浓度梯度。吸取100 μL土壤稀释液分别涂布至加有抑制剂制霉菌素、重铬酸钾、万古霉素的分离培养基上，28℃培养2～3周至单菌落出现。

1.2.2菌株发酵粗提物制备将分离纯化的放线菌接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶中，28℃，220 r/min摇床振荡培养7 d。离心除去菌体，收集发酵液。

1.2.3活性检测（1）滤纸片法：吸取甲醇溶解的乙酸乙酯萃取物50 μL于直径为5 mm的圆形无菌滤纸片上，置于指示菌平板上，在指示菌适合的温度培养后观察，并用游标卡尺测定其抑菌圈大小[17]。（2）MTT法：先将肿瘤细胞进行传代培养，然后进行活性测定，用酶标仪在波长595 nm下测OD值，计算各个样品对肿瘤细胞的抑制率[18]。

1.2.4菌株DNA提取与16S rRNA基因的PCR扩增采用溶菌酶法[19]快速提取放线菌基因组总DNA。采用细菌通用引物27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和1492 R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3′）进行PCR扩增[20]。纯化后的PCR产物交由上海英骏生物技术有限公司完成。

2　结果与分析

2.1稀有放线菌的选择性分离结果

对不同来源的6份样品进行分离，结果见表2。由表2可知，①不同样品分离的放线菌数差别大，厦门集美潮间带土样分离结果最理想；②相同土样采用不同培养基分离效果也各不同，以添加选择碳源聚乳酸的培养基分离效果最理想；③在6种选择分离培养基中，添加碳源聚乳酸的培养基分离效果最佳，不仅放线菌出菌率最高，种类丰富，稀有放线菌比例也较大。

表2　不同地点样品分离的放线菌数量及培养基类型

2.2分离菌株的多样性

通过形态观察，将分离到的160株放线菌进行初步分类，从中挑选出120株进行16SrRNA基因序列测定。将扩增的16SrRNA 基因序列在GenBank 中利用BLAST进行序列同源性分析，其中96株为链霉菌属之外的稀有放线菌，分属于5个亚目，7个科，11个属，分别是马杜拉菌属（Actinomadura）、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、诺卡氏菌属（Nocardia）、糖霉菌属（Glycomyces）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、韩国生工菌属（Kribbella）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、糖单孢菌属（Saccharomonospora）和姜氏菌属（Jiangella）。

2.3抗菌活性检测

对进行分子鉴定的96株稀有放线菌进行抗菌活性检测，结果如表3所示。有80株菌对7种靶标菌显示出一定的抗菌活性，其中抗Bacillus subtilis的活性菌株数最多，占供测菌株76.0%；抗革兰氏阴性菌Escherichia coli的菌株较少，占供测菌株41.7%；抗2种真菌靶标菌的菌株最少，分别占供测菌株的18.8%和12.5%。这些活性菌株以马杜拉菌属和拟无枝酸菌为主。

表3　96株稀有放线菌的抗菌检测

2.4抗肿瘤活性检测

由表4可知，对HeLa细胞有细胞毒活性且样品浓度为50 μg/mL的有53株，占总供测菌株的55.2%；样品浓度为100 μg/mL的有70株，占总供测菌株的72.9%；对HepG2细胞有细胞毒活性且样品浓度为50 μg/mL的有42株，占总供测菌株的43.8%；样品浓度为100 μg/mL的有61株，占总供测菌株的63.5%。在96株稀有放线菌中，共有78株呈现出对HeLa或HepG2具有不同程度的细胞毒活性，占供测菌株的81.3%。

表4　96株稀有放线菌的抗肿瘤活性检测

3　讨　论

目前，已发现的天然产物多数来自于链霉菌，为了开发新的天然产物，研究者们不断将眼光转向稀有放线菌[3]。试验结果显示，在分离培养基中添加聚乳酸和丝蛋白粉，共获得160株放线菌。经16SrRNA基因序列分析，这些菌株分属于5个亚目，7个科，11个属。这与Yutaka等[15]筛选到的降解聚乳酸的放线菌属于Pseudonocardiaceae家族以及相关菌属的结果有些类似。除此之外，还分离到韩国生工菌属、野野村氏菌属、诺卡氏属、姜氏菌属、糖霉菌属和拟诺卡氏菌属的菌株，这均为首次报道。目前，利用聚乳酸和丝蛋白粉作为培养基成分来分离稀有放线菌的报道较少见，进一步证实这两种复合成分在稀有放线菌分离上有着较大的研究开发潜力。

活性测定结果显示，供试菌株有一半以上具有抗藤黄微球菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的活性，而对大肠杆菌有抗菌活性的菌株数目不多。对两种真菌靶标菌有抗菌活性的菌株较少，如马杜拉菌属只有4株菌株具有抗两种真菌靶标菌的活性；野野村氏菌属中只有1株菌株具有抗两种真菌靶标的活性。大多数菌株都显示出对HeLa或HepG2两种肿瘤细胞株有较强的抑制能力，说明菌株的次级代谢产物中可能含有抗肿瘤活性的化合物。对于以上检测到活性强的菌株大部分分布在马杜拉放线菌属和拟无枝酸菌属，活性好的菌株可为次级代谢产物的研究提供良好的资源。

要避免优良菌株的漏筛，提高天然产物的分离率，必须不断建立新的筛选模型，不能局限于抗菌和抗肿瘤活性的筛选。研究只是对海洋环境中的土样进行稀有放线菌的分离，结果表明，海洋中蕴藏着丰富的稀有放线菌资源。而一些极端环境、未开发的原始森林环境中必然也含有大量具有利用价值的菌株和更多未知的放线菌群，值得深入研究。

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（责任编辑：成平）

Selective Iolation and Identification of Rare Actinomycetes from Marine Habitats and Its bioactivity

LIU Zui，LI Yu-zhong，LIN Hui-min，SONG Rui-hong
（College of Life Science and Environment Heng Yang Normal University, Hengyang 421008, PRC）

Poly-L-lactic acid and silk protein powder as selective carbon， nitrogen for isolation of rare actinomycetes is worth further researches. Marine habitats are rich in rare actinomycetes with bioactivity and may be an effective method of finding new medicine. This study was aimed to isolate and identify rare actinomycetes with bioactivity isolated from marine habitats. Rare actinomycetes were isolated using poly-L-lactic acid and silk protein as a selective carbon， nitrogen from six samples by agar plate dilution method. To test the biological active effects， we used paper-disk method with seven indicator organisms to detect the antimicrobial activity by its fermentation extracts，MTT assay with 2 human tumor cell lines to monitor anti-tumor activitiy. Among of them， by eliminating the same strains from one genus and then 120 strains were identified by 16SrRNA gene sequence analysis， 96 strains were classified into 11 genera besides Streptomyces. 80 strains displayed anti-microbial activities. Meanwhile， 78 strains displayed anti-tumor activities. Six types of culture medium for isolating rare actinomycetes had been compared， and results revealed that poly-L-lactic acid culture medium was the best for isolation.

rare actinomycetes; selective isolation; poly-L-lactic acid; silk protein; bioactivity screening

Q939.13

A

1006-060X（2016）10-0004-03

2016-07-13

衡阳师范学院基金青年项目（14A04）；衡阳市科技局一般项目（2015KJ25）

刘 最（1984-），女，湖南邵阳市人，实验员，主要从事放线菌分类研究。