缺氧诱导因子-1和果蝇zeste基因增强子人类同源物蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义

司瑞丽, 李晓凤, 张美云, 刘 卓

(1.包头医学院,内蒙古包头 014040；2.包头市肿瘤医院综合内科)



缺氧诱导因子-1和果蝇zeste基因增强子人类同源物蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义

司瑞丽1, 李晓凤2, 张美云2, 刘 卓1

(1.包头医学院,内蒙古包头 014040；2.包头市肿瘤医院综合内科)

目的:研究缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)和果蝇zeste基因增强子人类同源物(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白在结直肠癌组织及正常组织的表达，并探讨与临床病理因素的关系及两者表达的相关性。方法:应用免疫组织化学法分析检测HIF-1和EZH2蛋白的表达情况并同时分析两者表达的相关性。结果:HIF-1和EZH2蛋白在结直肠癌组织中高表达，在正常组织中低表达或无表达，差异有统计学意义(P<0.05)。两者的表达与性别、年龄、是否吸烟、分期及病理类型未见相关(P>0.05)，与淋巴结转移及浸润密切相关(P<0.05)。两者间在组织中表达呈正相关(r=0.413，P=0.018)。结论:HIF-1和EZH2蛋白在结直肠癌的发生发展中发挥着重要作用，且有可能作为临床判断预后的标志物。

缺氧诱导因子-1；果蝇zeste基因增强子人类同源物；结直肠癌

结直肠癌的发生是一个多因素、多步骤、内外因交互作用的结果，目前从整体层面上研究基因调节的网络及结构基因组和功能基因组水平研究结直肠癌演变机制越来越引起人们的重视，一些与细胞增殖有关的蛋白如缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)和果蝇zeste基因增强子人类同源物(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白在肿瘤发生中过程的作用也受到了高度重视。研究发现在多种肿瘤中高表达的HIF-1蛋白，可作用于多个靶基因,使肿瘤细胞适应缺氧环境，并可以介导肿瘤的增殖、侵袭及转移。EZH2蛋白作为表观遗传学研究中一个重要酶类，通过与组蛋白去乙酰化酶、DNA甲基转移酶共同作用，沉默抑癌基因表观遗传性，促进肿瘤的发生发展。且两者表达呈正相关，两者通过微核糖核酸101(micro ribonucleic acid101,miRNA101)取得相关性，EZH2的表达和功能受miRNA101的抑制，而miRNA101的表达受缺氧诱导因子的调控[1]。

1 对象与方法

1.1 对象 选取包头市肿瘤医院病理科2013年1月至2014年12月结、直肠癌患者存档蜡块，包括结、直肠癌蜡块及同一患者距肿物5cm以上的正常结、直肠黏膜组织蜡块，所有标本的临床和病理资料均完整，病理诊断明确。结、直肠癌蜡块60例为观察组，所有入组标本来源患者术前均未做过任何化疗、放疗或其他药物等治疗，其中男性35例，女性25例，年龄>50岁42人，<50岁18人，吸烟者38人，非吸烟者22人，分期：Ⅰ+Ⅱ期者34人 Ⅲ+Ⅳ期者26人，有淋巴结转移者38人，无淋巴结转移者22人，高分化者21人，低分化39人，病理类型腺癌者27人，黏液腺癌者33人。观察组患者中随机抽取30例，取正常结、直肠黏膜组织蜡块为对照组。

1.2 仪器 TP1220型自动脱水机、1150H型病理组织包埋机RM2245型切片机、HI1220型摊片烤片机，GZX-DH数显电热保温箱，上海跃进医疗器厂，BX41光学显微镜，LOGENE-1图像采集系统，尚朋堂电压力锅。

1.3 试剂 EZH2兔抗人单克隆抗体，HIF-1兔抗人单克隆抗体,SP通用型免疫组化试剂盒DAB显色试剂盒

1.4 方法

1.4.1 免疫组织化学法 检测HIF-1和EZH2蛋白在结直肠癌组织及正常组织中的表达情况，选取病理科存档蜡块,用Evision免疫组化(两步法)，其具体步骤严格按照试剂盒说明书进行，并采用Olympus光学显微镜观察结果，并摄片保存。采用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4.2 阳性结果的判断 参照文献[2]选定阳性结果判定标准：EZH2表达于细胞质或细胞核中棕黄色颗粒为阳性表达，HIF-l蛋白定位于细胞核及部分胞质中，棕色或棕褐色为阳性，阳性结果判定标准：高倍镜下阳性细胞数占视野10 %以上；高倍镜下阳性细胞数占视野10 %以下计为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，比较EZH2及HIF-1与不同临床病理参数，用卡方检验，以P<0.05时为差异有统计学意义。比较EZH2与HIF-1两者表达相关性时应用Spearman等级相关分析方法进行统计学分析。

2 结果

2.1 EZH2和HIF-1蛋白在结肠癌组织及正常组织中的表达情况 EZH2蛋白在癌组织中主要定位于细胞核，部分位于细胞质(图1)；阳性率为75.0 %，癌旁正常组织中的阳性率为40.0 %。HIF-1蛋白在癌组织中主要定位于细胞核，部分位于胞质，阳性细胞呈清晰棕色或棕褐色(图2)；阳性率为63.3 %，在癌旁正常组织中的阳性率为10.0 %。结直肠癌组织中HIF-1、EZH2蛋白表达与其对应癌旁组织中的表达见表1。

表1 EZH2和HIF-1蛋白在结肠癌组织及正常组织中的表达

2.2 EZH2和HIF-1分别与不同临床病理参数之间的表达相关性 EZH2和HIF-1蛋白表达与性别、年龄、是否吸烟、分期及病理类型无相关(P>0.05)，与淋巴结转移及分化密切相关(P<0.05)。见表2。

表2 EZH2和HIF-1分别与不同临床病理参数之间的表达相关性

2.3 EZH2和HIF-1在结肠癌组织中的表达相关性 EZH2与HIF-1蛋白表达密切相关(P<0.05)。见表3。

表3 EZH2和HIF-1在结肠癌组织中的表达相关性

3 讨论

HIF-1作为一种氧依赖转录激活因子，具有相当广泛的靶基因谱。HIF-1可通过上调基质金属蛋白的表达及抑制细胞间E-钙黏蛋白表达来促进肿瘤侵袭转移。其作用靶点有血管内皮生长因子激活体内一系列的缺血转导通路，诱导生成血管，提高毛细血管通透性，从而缓解肿瘤组织、细胞的缺氧缺血，调节肿瘤组织的新陈代谢、肿瘤细胞的增殖及血管生成。

EZH2来源于多梳((polycomb group，PcG)基因家族，其表达依赖完整的SET结构域，EZH2能减少转录因子与DNA结合抑制靶基因的表达，作用于pRb2/p130蛋白C-碳末端与组蛋白去乙稀化酶相联的区域，恢复pRb2/p130-组蛋白去乙稀化酶复合物介导的细胞周期素A启动子的活性，最终促进细胞周期演进和恶性转变。

EZH2和HIF-1蛋白表达呈正相关。这两种蛋白通过miRNA这一纽带在肿瘤的发生发展中取得联系。miRNA101表达和直肠癌等多种癌前病变相关，如炎症，Wnt/β钙黏蛋白-通路的激活，上皮间质转化有关。而HIF-1介导肿瘤细胞适应缺氧微环境主要是通过激活WNT/β-钙黏蛋白通路、转化生长因子-β/Smad等通路来实现的。并有研究表明，miRNA101的表达受雄激素受体及缺氧诱导因子的抑制[1]。miRNA101可以抑制EZH2的表达和功能，在进展期肿瘤中miRNA101表达下调出现EZH2的表达增加及表观路径的失活，促进肿瘤发生。在前列腺癌细胞研究中发现HIF-1α可以通过抑制miRNA101表达促进EZH2蛋白表达。上调miRNA101可以抑制结直肠癌,通过靶向作用限制结直肠癌在体内的活性。在缺氧环境中，肿瘤细胞内HIF转录表达显著性增加，诱导EZH2表达促进肿瘤。

Chang等[3]在研究乳腺癌中发现，缺氧调控EZH2表达，控制脱氧核糖核酸损伤修复，激活P-ERK-β蛋白通路激活，导致乳腺癌细胞增殖，大多数因缺氧导致氯乙基三氮烯咪唑酰胺HIF-1a介导反式激活，促使EZH2的表达显著增强，反过来又促进氯乙基三氮烯咪唑酰胺的扩张和癌症进展。张磊等[4]研究，胃癌细胞中HIF-1α蛋白和EZH2蛋白的表达，结果表明EZH2蛋白与HIF-1α蛋白表达呈正相关，提示胃癌细胞中可能存在HIF-1α/EZH2信号途径。

MicroRNA家族与CRC的相关基因和通路有着广泛的联系，认识miRNA及EZH2和HIF-1蛋白之间的相互调控关系，可以更清楚地了解CRC产生过程中的不同的癌变机理，EZH2和HIF-1有望成为临床判断预后的肿瘤标志物。

[1] Smits M,Mir SE,Nilsson RJA,et al.Down-regulation of miR-101 in endothelial cells promotes blood vessel formation through reduced repression of EZH2[J].PLoS One，2011,6(1)：e16282.

[2] 许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准.中国癌症杂志，1996,6(4)：229-231.

[3] Chang CJ，Yang JY，Xia W，et al.EZH2promotes expansion of breast tumor initiating cells through activation of RAF1-beta-cate-nin signaling[J].Cancer Cell，2011，19(1)：86-100.

[4] 张磊，孙雪竹，孙景洲，等.胃癌中HIF-1α、EZH2的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(12):1364-1365.

Expressions of HIF-1 and EZH2 protein in colorectal carcinoma and their clinical significance

SI Ruili1, LI Xiaofeng2, ZHANG Meiyun2, LIU Zhuo1

(1.BaotouMedicalCollege, 014040Baotou,China;2.GeneralMedicalDepartmentofBaotouTumorHospital, 014040Baotou,China)

Objective:To study the expressions of HIF-1 and EZH2 protein in colorectal carcinoma and normal issues and to explore their relationship with clinical pathological features and their expression correlation. Methods: The immunohistochemistry method was applied to determine the expression of HIF-1 and EZH2 protein，and their correlation was statistically analyzed.Results: There was significant difference with high expression of HIF-1 and EZH2 protein in human colorectal carcinoma tissues and low or no expression in normal tissues (P<0.05). Their expressions had no relationship with gender, age, smoking, clinical stage and pathologic type (P>0.05)，but were closely associated with lymphatic vessel invasion and metastasis (P<0.05). Their expressions in the tissues were positively correlated(r=0.413，P=0.018). Conclusion:The expressions of HIF-1 and EZH2 protein may be closely related to the occurrence and development of colorectal carcinoma and can be used as potential prognostic marker.

HIF-1; EZH2; Human colorectal carcinoma

李晓凤

2015-09-04)