饮水砷的遗传毒理学研究

赵书婷，曲 琳，尹幸念，钱毅春，张晓丽，白国辉，王素华，王海玲

(1.包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014060；2.包头医学院2013级硕士研究生；3.内蒙古疾病预防控制中心卫生毒理所)



饮水砷的遗传毒理学研究

赵书婷1，2，曲 琳3，尹幸念3，钱毅春3，张晓丽1，白国辉1，王素华1，王海玲3

(1.包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014060；2.包头医学院2013级硕士研究生；3.内蒙古疾病预防控制中心卫生毒理所)

目的：探讨饮水砷的遗传毒理作用，为饮水型砷中毒的防治与监测提供科学的理论依据。方法：采用经典的Ames(鼠伤寒沙门氏菌回复突变)试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验。结果：Ames试验的结果为阴性；小鼠骨髓细胞微核试验中，0.09 μg/kg剂量组的雌、雄鼠和0.03 μg/kg剂量组的雌鼠微核率分别为4.60 ‰、5.40 ‰、6.60 ‰，与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；小鼠精子畸形试验中，3个剂量组剂量分别为0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg的精子畸形率与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论：饮水砷对原核细胞未显示致突变作用，在真核细胞体内显示对染色体具有损伤作用并对生殖细胞产生遗传毒性。

饮水砷；遗传毒性；Ames试验；小鼠骨髓细胞微核试验；小鼠精子畸形试验

砷是广泛分布于自然界中的非金属元素，环境中的砷主要通过水体转运进入人体。地方性砷中毒是一种典型的因长期饮用高砷水(国家标准<0.05 mg/L)造成的中毒性疾病。水砷是人群暴露的主要途径，饮水砷主要以无机砷的形式存在，无机砷进入机体后的代谢过程十分复杂，经过二次氧化甲基化和二次还原过程[1]，被催化生成五价二甲基砷(DMA5+)[2]，最终代谢物对机体产生损伤作用。流行病学研究表明，慢性饮水型高砷暴露与心血管系统、神经系统疾病，糖尿病以及多组织器官恶性肿瘤的发生密切相关[3]。我国饮水型高砷暴露地区主要分布在内蒙古、山西、新疆等地[4]。目前大部分研究主要涉及地方性砷中毒监测、砷在头发、血液、尿液等样品含量的测定，慢性砷暴露可诱发恶性肿瘤、肺癌等相关研究也有个别报导，但饮水砷暴露对机体遗传损伤毒性作用研究较少见。本研究通过Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验研究饮水砷的遗传毒性，了解其发生原因与作用机制，为饮水型砷中毒的防治与监控提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株、动物 鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102为实验室冻存菌株。本实验室对菌株特性进行鉴定，符合Ames试验标准。SPF级健康昆明种小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号：SCXK(京)2012-0001；饲料来源于北京科澳协力饲料有限公司，饲料合格证号：SCXK(京)2009-0012；动物房屏障系统使用许可号：SYXK(蒙)2010-0001。

1.1.2 受试物和主要试验试剂

1.1.2.1 受试物 准确吸取一定量的砷标准溶液，用无菌蒸馏水定容到450 μg/L，依次稀释成不同浓度。

1.1.2.2 主要试验 2，4，7-三硝基-9-芴酮和叠氮钠(Fluka公司)、MMS(Merck公司)、2-AF和1，8-二羟基蒽醌(上海试剂厂)、氧化型辅酶Ⅱ、6-磷酸葡萄糖钠盐、L-组氨酸(Sigma公司)、生物素(Sigma公司)、S9(本实验室按Ames方法制备，液氮保存，批号20130713)、胎牛血清、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甲醇、环磷酰胺、Giemsa染液。

1.2 方法

1.2.1 Ames试验 采用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4种菌株，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝均浆制备的S9混合液。选用菌株TA100进行预试验，计数每个平皿中的回变菌落数。将无菌蒸馏水定容到450 μg/L的砷标准溶液作为受试样品，用无菌蒸馏水稀释到不同浓度，检测剂量分别设定为0.0450 μg/皿、0.0150 μg/皿、0.0050 μg/皿、0.0017 μg/皿、0.0006 μg/皿。设空白对照、溶剂对照和阳性对照，不同菌株使用不同的阳性致畸物。溶剂对照为100 μL/皿的无菌蒸馏水，在加和不加S9的试验条件下进行平板渗入法试验；每组设3个平行样品，实验重复1次。

1.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验 选用SPF级健康昆明种小鼠50只，体重25～30 g、平均体重26.02 g，按体重随机分为5组，每组10只，雌、雄各半。受试物组剂量分别为0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg，阴性对照组给蒸馏水，阳性对照组经口给予环磷酰胺40 mg/kg，灌胃量为0.2 mL/10 g。采用30 h给受试物法，两次给受试物间隔24 h，于第2次灌胃6 h后颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓涂片、固定、染色、镜检。每鼠计数1 000个嗜多染红细胞(PCE)的微核细胞数，观察200个PCE，计数同时观察到的正染红细胞(NCE)数目，计算PCE/NCE比值。

1.2.3 小鼠精子畸形试验 选用雄性昆明种小鼠25只，体重25～35 g、平均体重30.58 g，按体重随机分为5组，每组5只，设3个剂量组，剂量分别为0.09 μg/kg、0.03 μg/kg、0.01 μg/kg，另设溶剂(蒸馏水)对照组和环磷酰胺阳性对照组(40 mg/kg)。经口灌胃1次/d，灌胃量均为0.2 mL/10 g，连续灌胃5 d，于首次给受试物后第35 d脱颈椎处死动物，取双侧副睾制片，按《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193.7-2003中的规定，经甲醇固定、1 %伊红染液染色后，于高倍镜下对每只小鼠计数1 000条完整精子，记录精子畸形数、畸形类型，计算精子畸形发生率。

1.2.4 数据处理 试验数据使用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 受试物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型回变菌落数的影响 计数每个平皿中的回变菌落数，在加或不加体外代谢活化系统S9时，受检样品饮水砷诱发鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，无剂量反应关系，可判定结果为阴性。见表1、表2。

表1 受试物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型回变菌落数的影响

a为2，4，7-三硝基-9-芴酮，0.2 μg/皿；b为2-氨基芴(2-AF)，50.0 μg/皿；c为叠氮钠，2.0 μg/皿；d为甲基磺酸甲酯(MMS)，3.0 μL原液；e为1，8-二羟基蒽醌，50.0 μg/皿

表2 受试物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型回变菌落数的影响

a为2，4，7-三硝基-9-芴酮，0.2 (g/皿；b为2-氨基芴(2-AF)50.0 (g/皿；c为叠氮钠，2.0 (g/皿；d为甲基磺酸甲酯(MMS)，3.0 (L原液；e为1，8-二羟基蒽醌，50.0 (g/皿

2.2 受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响 受试物3个剂量组的微核率与阴性对照组比较，雌、雄鼠的高剂量组及雌鼠的中剂量组微核率差异均有统计学意义(P<0.05)，雌、雄鼠的低剂量组及雄鼠的中剂量组与阴性对照组的微核率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 受试物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

a为与阴性对照组比较P<0.05

2.3 受试物对小鼠精子畸变率的影响 受试物3个剂量组及阳性对照组的精子畸形率与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 受试物对小鼠精子畸形率的影响

a为与阴性对照组相比P<0.01

3 讨论

Ames试验结果显示，受试物未增加鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株的回复突变数，与以往文献报道结果相同。Ames试验是一种有效检测受试物能否引起鼠伤寒沙门氏菌基因组碱基置换或移码突变的方法。在本次饮水砷Ames试验中，砷未能引起碱基置换、移码或缺失。其它研究表明，虽然砷和腐植酸共同作用有微弱的致突变性，但砷在Ames试验中单独作用没有致突变性。沙门氏菌属具有很强的抵抗有毒重金属砷的能力，所以该实验剂量未观察到对菌株的影响。

在本研究中，小鼠骨髓细胞微核试验高剂量组结果为阳性。砷具有较强的染色体损伤作用，可扰乱纺锤体结构，影响正常的有丝分裂过程，使染色质无法正常进入细胞核，诱导微核的形成，导致微核率的增加[5]。砷是一种有丝分裂毒物，使体内产生姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange,SCE)的机率增加，染色体畸形(chromosome abnormalities,CA)和微核(micronucleus,MN)的数量增加，且中毒越严重遗传损伤也越严重，最终影响细胞的有丝分裂。有报道，砷可诱发染色体损伤，与本实验结果相符。本研究的小鼠精子畸形试验结果为阳性，表明砷可引起精子畸形，主要畸形类型包括胖头、无定形、无钩等，对机体有明显的生殖细胞损伤作用，与众多的研究得出相似的结论[6]，其机制可能与砷使生殖细胞的基因发生突变或干扰基因的表达过程有关[5]。精子形态的改变反映了雄性生殖细胞的遗传损伤。

综上所述，通过体外试验和动物体内试验表明，饮水砷对原核细胞未显示致突变作用，对真核细胞染色体有损伤作用并对生殖细胞产生遗传毒性。提示应严格控制饮用水中砷的含量，降低饮水砷引起的遗传损伤程度。

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[2] 陈保卫,那仁满都拉,吕美玲,等.砷的代谢机制、毒性和生物监测[J].化学进展,2009,21(2/3):476-482.

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Study on genetic toxicology of arsenic in drinking water

ZHAO Shuting1, QU Lin2, YIN Xingnian2, QIAN Yichun2,ZHANG Xiaoli1, BAI Guohui1,WANG Suhua1,WANG Hailing2

(1.PublicHealthSchoolofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China2.Postgraduate2013 ,BaotouMedicalCollege3.InstituteforToxicologyofInnerMongoliaCenterforDiseasesControlandPrevention)

Objective:To explore the genotoxicity of arsenic in drinking water and provide scientific basis for the prevention and treatment of arseniasis in drinking water. Methods：Ames test, bone marrow cell micronucleus test and mice sperm abnormality test were adopted. Results：Ames test results were negative; In bone marrow cell micronucleus test, the micronucleus rate of the male and female mice in the 0.09 μg/kg dose group and the female mice in the 0.03 μg/kg dose group was 4.60 ‰, 5.40 ‰ and 6.60 ‰ respectively. Compared with that of the negative control group, the difference was of significance (P<0.05); Mice sperm abnormality test results were positive; the sperm deformity rate of the three groups was 0.09 μg/kg, 0.03 μg/kg, and 0.01 μg/kg respectively; compared with that of the negative control group, the difference was significant (P<0.01). Conclusion：Arsenic in drinking water has no mutagenic effect in prokaryotic cells, but it will damage the chromosomes of eukaryotic cells and has genotoxic effect on germ cells.

Arsenic in drinking water; Genotoxicity; Ames test; Bone marrow cell micronucleus test; Mice sperm abnormality test

王素华，王海玲

2016-02-23)