贵州遵义地区蝙蝠脑组织博尔纳病病毒磷蛋白的检测

杨利玲 雷以会 徐 平

(遵义医学院第一附属医院，遵义，563000)

贵州遵义地区蝙蝠脑组织博尔纳病病毒磷蛋白的检测

杨利玲 雷以会 徐 平

(遵义医学院第一附属医院，遵义，563000)

修回日期：2015-12-05

发表日期：2016-05-10

蝙蝠；

博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)最早发现于19世纪德国的Borna镇，是一种新型的传染病病毒。该病毒曾引起当地战马中爆发一类致死性的脑炎，主要临床症状为精神行为异常(姿势步态异常，动作减少或多动，震颤、四肢抽动等)。BDV为严格嗜神经性的RNA病毒，其主要自然感染宿主为马和羊，随着对BDV研究的深入，发现BDV有着更广泛的自然感染宿主，也能感染人类发生神经精神类疾病。BDV基因组中包含6个开放阅读框，其中ORFⅠ、ORFⅡ包含的序列相对保守，变异性更小，成为检测病毒感染的特异性指标。目前发现在感染脊椎动物的16个RNA病毒科中，至少有9个与蝙蝠相关[1]。最近肆虐西非的埃博拉病毒、上世纪末马来西亚的尼帕病毒、澳大利亚的亨德拉病毒以及SARS病毒都已经被证实其真正的自然宿主为蝙蝠[2]。蝙蝠是哺乳动物中唯一能飞行的动物，并且有些种类蝙蝠的寿命可以超40 a，为病毒的传播创造了有利条件。随着城市的扩张以及部分蝙蝠在城市中定居，使人和蝙蝠之间接触机会不断增加。故本实验选取BDV ORFⅡ编码的磷蛋白为检测对象，应用蛋白免疫印迹法(western blotting，WB)检测贵州省遵义地区蝙蝠脑组织BDV磷蛋白(Borna disease virus phosphoprotein，BDV-P)，旨在了解蝙蝠是否为BDV的自然感染宿主，结合前期工作分析BDV的分子流行病学特征，为了解和预测潜在的博尔纳病爆发和流行的可能性奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

2014年5～9月之间，收集贵州省遵义市绥阳地区野生蝙蝠82只，取蝙蝠额颞叶脑组织放入去酶的1.5 mL EP管，依次编号。并立即放于-80℃的超低温冰箱保存。采集过程中严格按照无菌操作收集标本，避免样品间交叉污染。

1.2 主要仪器和试剂

兔源BDV-P24多克隆抗体，碱性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase，AP)标记的羊抗兔多克隆抗体(由重庆医科大学神经学实验室提供)。

1.3 实验方法

1.3.1 提取蛋白

每份脑组织标本称取100 mg于EP管中，按每100 mg脑组织加入500 mL蛋白提取液，每1 mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂、10 μL磷酸酶抑制剂、10 μL苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，充分振荡混匀后冰上保存、分装。待标本与蛋白裂解液充分接触后在超声细胞裂解仪上充分裂解，此步骤在冰上操作，直至为均匀的混合液为止。高速低温离心机140 000 bpm 15 min，上清液即为所得的蛋白质。

1.3.2 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法测蛋白浓度及蛋白定性

抽取5份蛋白质样品，按BCA法进行蛋白定量，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。每份样品取50 μL，按1∶3的比例加入1×Loading Buffer，充分振荡混匀后放在恒温器上变性，100℃ 10 min，变性后-20℃冰箱保存。

1.3.3 确定最佳抗体稀释浓度

将OL/BDV细胞裂解抗原分别与不同稀释浓度的BDV-P24兔多克隆抗体(一抗)(1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000)和AP标记的羊抗兔IgG(二抗)(1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000)交叉反应，根据发光结果，确定最佳稀释浓度。

1.3.4 WB检测BDV磷蛋白

将提取的样品蛋白经12% SAS-PAGE电泳，同时加入阳性蛋白标本(由重庆医科大学神经病学实验室惠赠)作为阳性参照物。采用“三明治”形式进行半干转，将蛋白转移至固相载体(PVDF膜)上，转膜完全后将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中进行封闭。与BDV-P24兔多克隆抗体按最佳稀释浓度进行一抗孵育，4℃过夜(孵育时间大于15 h)。PBST快速洗涤3次，每次15 min，将AP标记羊抗兔IgG按最佳稀释浓度行二抗孵育，室温下孵育2 h。PBST充分洗涤3次，每次15 min。最后按从弱到强滴加发光剂，反应5 min。曝光，扫描保存。

2 结果

2.1 按BCA法根据标准曲线确定样品蛋白浓度，其相关系数为0.999，样品蛋白的浓度约为1 μg/μL。

2.2 将BDV感染的OL裂解细胞抗原与不同浓度BDV-P24兔多克隆抗体(一抗)和AP标记羊抗兔IgG(二抗)进行交叉反应的WB方法确定最佳稀释浓度，一抗和二抗的最佳稀释浓度分别为1∶1 000和1∶5 000。

2.3 82只野生蝙蝠脑组织中BDV磷蛋白阳性9例(阳性率为11%)，发光结果见图1。

图1 蝙蝠脑组织BDV磷蛋白WB曝光结果(+为阳性对照，-为阴性对照，1～9实验标本)Fig 1.The results of western blot BDV phosphoprotein in bat brain tissue.(+ was positive control，-was negative control，1-9 were test specmens)

3 讨论

博尔纳病病毒(borna diseaase virus，BDV)为含有包膜未分节段的单股负链RNA病毒，是目前博尔纳病毒属、博尔纳病毒科中唯一的成员，其复制和转录都在细胞核内进行，目前结合博尔纳病毒的系统树分析以及生物学特征表面博尔纳病毒属至少有5个种类：Ⅰ、哺乳动物类BDV-1，包括传统的博尔纳病毒和流行株NO/98；Ⅱ、鹦鹉类BDV-1，包括鸟以及鹦鹉类BDV-1、2、3、4、7；Ⅲ、雀形类BDV-1：包括鸟以及亚尼沙爱金丝雀BDV-L1、L2、L3、LS；Ⅳ、雀形类BDV-2：梅花雀BDV EF；Ⅴ、水禽BDV-：鸟BDV 062CG[3]。BDV地理分布较广泛，遍及日本、澳大利亚、伊朗、意大利、瑞士、德国、土耳其等均有关于BDV感染动物或人的相关报道[4]。2010年研究者Horie和Belyi[5-6]在人和其他脊椎动物中发现了EBL(endogenization borna like，EBL)基因序列，在部分微型蝙蝠中也发现了EBL-N、EBL-L、EBL-M基因序列。EBL基因序列与BDV已知的标准株基因序列相似性达40%以上，而且Kinnunen[7]认为EBL基因序列特别是EBL-N基因序列可以使一类物种更有机会成为BDV携带者。可能蝙蝠在BDV流行病学中也扮演重要的角色。

本实验采用WB方法检测贵州省遵义市绥阳地区野生蝙蝠脑组织中是否表达BDV-P，发现9例(9/82)标本阳性，阳性率11%，表明遵义绥阳地区的蝙蝠可能为BDV自然感染携带者，与学者Horie的研究结果相吻合。结合前期本课题组成员王长明[8]采用FQ-nRT-PCR方法对遵义地区山羊PMBC中的BDV-P24基因片段、刘海军[9-10]用FQ-nRT-PCR对遵义及周边地区牛群中PMBC中的BDV-P24基因片段的检测以及用ELISA检测贵州部分地区病毒性脑炎、吉兰-巴雷综合症等神经系统疾病患者中血清中BDV抗原、特异性抗体以及抗原-抗体免疫复合物，说明遵义地区可能为BDV流行地区之一。本实验以蝙蝠脑组织BDV-P为检测对象，其阳性率明显高于前期成员检测PBMC中BDV-RNA研究结果，一方面可能由于脑组织中BDV相关蛋白过量表达，另一方面可能由于在PBMC中病毒RNA复制低或者已降解的RNA[11]。

近年来文献报道BDV出现许多新的自然感染宿主，如蝙蝠、啮齿动物以及食虫类[12]。但感染BDV动物的耐受机制以及感染途径仍不清楚，但研究者通过实验证明BDV极有可能是通过嗅神经、三叉神经或者是舌咽神经进行传播，也能通过被感染动物的分泌物进行传播。Okamoto等[13]研究者实验性的感染小鼠发现BDV即可以水平传播，也能垂直传播。有研究报道认为BDV感染可能为动物源性，BDV可以从感染BDV的动物向人类传播，人类与蝙蝠同属于哺乳动物，古老的病毒可能在人和蝙蝠的细胞膜上都有相应的病毒受体[14-15]，这样人类和蝙蝠都有可能成为BDV感染的携带者。遵义绥阳地区林业较为发达，蝙蝠活动范围较大，蝙蝠分泌物可能会污染当地农作物间接传播给人类，走访当地人生活习惯，发现他们主要是自给自足，并且有一部分人曾食蝙蝠，使当地居民感染BDV的概率大大增加。

总而言之，贵州遵义绥阳地区蝙蝠可能为BDV的自然感染宿主，因此，本研究结果丰富了贵州省BDV分子流行学资料，有助于对潜在的BDV感染爆发流行做好防范工作。但由于收集标本的局限性以及样本数量较少，后续研究还需扩大样本量以及多地区的收集标本，以及了解其他可能携带BDV的物种。

[1] 李志峰，俞守义，吴毅.广西岭景镇某山村蝙蝠携带 SARS 样冠状病毒及狂犬病毒的调查研究[J].医学动物防制，2007，23(10)：721-723.

[2] Rodhain E.Bats and viruses：complex relationship[J].Bulletin de la Societe de Pathologie Exotique(1990)，2015，108(4)：272-289.

[3] Kuhn J H，Durrwald R，Bao Y，et al.Taxonomic reorganization of the family Bornaviridae[J].Archives of Virology，2015，160(2)：621-632.

[4] Kinnunen P M，Palva A，Vaheri A，et al.Epidemiology and host spectrum of Borna disease virus infections[J].Journal of General Virology，2013，94(Pt 2)：247-262.

[5] Horie M，Honda T，Suzuki Y，et al.Endogenous non-retroviral RNA virus elements in mammalian genomes[J].Nature，2010，463(7277)：84-87.

[6] Belyi V A，Levine A J，Skalka A M.Unexpected inheritance：multiple integrations of ancient bornavirus and ebolavirus/marburgvirus sequences in vertebrate genomes[J].PLoS Pathogens，2010，6(7)：e1001030.

[7] Kinnunen P M，Palva A，Vaheri A，et al.Epidemiology and host spectrum of Borna disease virus infections[J].Journal of General Virology，2013，94(Pt 2)：247-262.

[8] 王长明，徐平，葛均江，等.贵州遵义地区山羊Borna病毒P24基因片段的检测[J].中国人兽共患病学报，2009，25(2)：149-151.

[9] 刘海军，王长明，谢婷婷，等.贵州省及部分周边地区牛博尔纳病病毒感染的情况调查[J].重庆医学，2011，40(32)，3296-3299.

[10] 刘海军，谢祖勤，郭霞，等.贵州部分地区精神分裂症患者血清PBMC博尔纳病病毒CIC及抗体的检测[J].贵州医药，2015，39(3)：203-206.

[11] Zhang L，Wang X，Zhan Q，et al.Evidence for natural Borna disease virus infection in healthy domestic animals in three areas of western China[J].Archives of Virology，2014，159(8)：1941-1949.

[12] Nobach D，Bourg M，Herzog S，et al.Shedding of infectious Borna disease virus-1 in living bicolored white-toothed shrews[J].PLoS One，2015，10(8)：e0137018.

[13] Okamoto M，Hagiwara K，Kamitani W，et al.Experimental vertical transmission of Borna disease virus in the mouse[J].Archives of Virology，2003，148(8)：1557-1568.

[14] Rackova S，Janu L，Kabickova H.Borna disease virus(BDV)circulating immunocomplex positivity in addicted patients in the Czech Republic：a prospective cohort analysis[J].BMC Psychiatry，2010，10(1)：70.

[15] Teplitsky V，Pitlik S，Richt J A，et al.Increased prevalence of Borna disease virus ELISA and immunofluorescent antibodies in horses from farms situated along the paths of migratory birds[J].Israel Journal of Veterinary Medicine，2003，58(2/3)：80-85.

Bats；BDV；Phosphoprotein；Western blot

DectionofBornaDiseaseVirusPhosphoproteininBrainTissueofBatsinZunyiRegion，GuizhouProvince

YangLilingLeiYihuiXuPing

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi，563000，China)

To investigate the status of Borna disease virus(BDV)natural infection in wild bats，we use the western blotting method to detect the phosphoprotein expression of BDV in 82 wild bat brain tissue specimens collected from the Zunyi region of Guizhou Province.Result showed that 9 of 82 specimens were phosphoprotein positive，which indicated that BDV natural infection exists in the bats in Zunyi region of Guizhou Province.

稿件运行过程

2015-10-29

BDV；

磷蛋白；

蛋白免疫印迹；

S858.9

A

2310-1490(2016)02-126-03

研究贵州省遵义地区野生蝙蝠脑组织中BDV自然感染情况。方法：采用蛋白免疫印迹检测贵州省遵义地区82只野生蝙蝠脑组织中BDV磷蛋白表达情况。结果：82只蝙蝠脑组织中BDV磷蛋白阳性9例(11%)。结论：贵州省遵义地区蝙蝠存在BDV自然感染。

国家自然科学基金，神经疾病与Borna病症毒感染的相关性研究

杨利玲，女，25岁，硕士研究生；主要从事中枢神经系统感染研究。E-mial：18798680327@163.com