反相高效液相色谱法分离纯化固相化学合成布舍瑞林

2016-11-18赵红玲王良友尹志峰

承德医学院学报 2016年2期

关键词：粗品冻干纯度

高杨，赵红玲，王良友，尹志峰

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

技术方法

反相高效液相色谱法分离纯化固相化学合成布舍瑞林

高杨，赵红玲，王良友，尹志峰

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

固相合成多肽；反相高效液相色谱法；纯化；分离

布舍瑞林（Bushruilin）是一种人工合成的促性腺激素释放激素类似物（GnRH-A），临床主要用于前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤等疾病的治疗，剂型为长效微球注射剂、植入剂、鼻腔喷雾剂、原位微粒，与天然促性腺激素释放激素（GnRH）相比具有半衰期长、活性强的特点［1-3］。布舍瑞林具有很高的药用价值和广阔的市场前景。目前，布舍瑞林合成方法为片段缩合法和逐一合成法，均经过全保护裂解、C端乙胺化、催化氢化、选择性脱三苯甲基（-Trt）几个步骤，纯度不高，因此其纯化条件的研究具有重要的意义［4-6］。

1 仪器与材料

Agilent Technologies 1200型高效液相色谱仪（UV检测器，美国Agilent公司），Newstyle型反相高效半制备液相色谱仪（苏州汉邦科技有限公司），AG-245电子分析天平（瑞士METTLER公司），Heal Force纯水机（香港力康公司），LGJ-18型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；布舍瑞林粗品（自制），布舍瑞林标准品（苏州中科天马肽工程中心有限公司）；乙腈（色谱纯，天津永大化学试剂有限公司），三氟乙酸（Sigma公司），超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 反相高效液相制备色谱：制备柱：Hedera C18（20mm×250mm，10 μ m）；流动相：A相0.1%TFA/水，B相0.1%TFA/乙腈；检测波长：214nm；进样量为500mg；线性梯度洗脱程序见表1：

表1 反相高效液相制备色谱线性梯度洗脱程序

2.1.2 反相高效液相分析色谱：分析柱：艾杰尔Venusil ASB C18（46mm×250mm，10μm）；流动相：A相0.1%TFA/水；B相0.1%TFA/乙腈；检测波长：214 nm；进样量为10 μ l；线性梯度洗脱程序见表2：

表2 反相高效液相分析色谱线性梯度洗脱程序

2.2 样品的制备精确称取500mg逐一合成法化学合成的布舍瑞林粗品，用离子交换缓冲液A（0.1%TFA/水）溶解，定容至250ml，得到2mg/ml的粗品溶液，经0.45nm滤膜过滤后供反相高效液相制备色谱使用。反相高效液相分析色谱的粗品和标准品及纯化后样品（反相高效液相制备色谱得到的冻干样品）需用流动相A（0.1%TFA/水）溶解，用稀盐酸调pH值至3，配制成1mg/ml的粗品和标准品及纯化后样品溶液，经0.45nm滤膜过滤处理。

2.3 检测波长肽键的强吸收峰在14nm处，为保证有较高的检测灵敏度，将布舍瑞林的检测波长设在UV 214nm处。

2.4 反相高效液相制备色谱分离纯化冻干按2.1所示反相高效液相制备色谱条件对布舍瑞林进行反相高效液相制备色谱分离纯化，将分离纯化后布舍瑞林进行反相高效液相色谱分析合并，所得样品置于冻干箱内隔板上进行预冻，制品温度下降至-40℃以下，维持20min；冻干，制品温度升至-60℃左右，降压至1Pa维持约12h。得白色粉末。

2.5 布舍瑞林的RP-HPLC分析分别准确移取10ml布舍瑞林的标准品溶液（1mg/ml）、粗品溶液（1mg/ml）和纯化后样品溶液（1mg/ml），按2.1的反相高效液相分析色谱条件操作，布舍瑞林在10.3min出峰。由外标法峰面积定量得布舍瑞林粗品的纯度为68.2%。化学合成法得到的布舍瑞林粗品组成较复杂，含有部分结构、性质和目标物相近的杂质，严重干扰了布舍瑞林的定性定量。在本色谱条件下，目标峰与其周围的杂质峰能得到一定程度的分开，表明该色谱条件适宜布舍瑞林粗品特别是反相高效液相色谱纯化后的布舍瑞林样品的分析，纯化后样品纯度为98%，纯化总收率为50.6%。