Aβ25-35对PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响*

张　美，狄婷婷，王瑞婷△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德护理职业学院）

Aβ25-35对PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响*

张美1，狄婷婷2，王瑞婷1△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德护理职业学院）

目的：观察A β25-35对PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法：采用10μmol/L Aβ25-35与PC12细胞共孵育48h建立阿尔茨海默病细胞模型，对照组细胞不加A β25-35。采用Hoechst 33258核染色法检测PC12细胞的凋亡情况，免疫细胞化学染色法检测PC12细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果：与对照组相比，实验组细胞Bcl-2的表达明显降低，细胞凋亡率、Bax蛋白的表达和Ba x/Bcl-2比值明显升高（P＜0.05）。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的机制可能与下调Bcl-2表达、上调Bax表达有关。

β淀粉样蛋白；PC12细胞；凋亡；Bcl-2；Bax

阿尔茨海默病（AD）是一种严重危害老年人身心健康的神经退行性疾病。临床研究证实，AD患者脑内的老年斑由β淀粉样蛋白（A β）异常沉积形成。研究发现A β能诱导神经元凋亡，其诱导细胞凋亡的机制也因此成为研究AD发病的热点之一［1-2］。PC12细胞具神经内分泌特性，与原代培养的神经细胞相比容易获得、便于观察，被广泛用于神经系统体外模型的制作和研究，如AD、帕金森氏病等［3］。本研究采用10 μ mol/L A β25-35作用于PC12细胞，通过Hoechst 33258核染色，免疫细胞化学染色检测Bcl-2和Bax的表达水平，分析A β对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 A β25-35，北京博奥森生物技术有限公司；兔抗大鼠Bcl-2多抗、兔抗大鼠Bax多抗、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；PC12细胞（CX0247）、FBS，武汉博士德生物工程有限公司；DMEM，GIBCO公司；胰酶，上海蓝基科技发展有限公司。

1.2 细胞培养 PC12细胞培养在含10% FBS的高糖DMEM培养液中，隔天换液胰酶消化传代。采用对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞爬片制备和指标检测 将洁净盖玻片置于24孔板，种入对数生长期细胞，培养过夜使细胞生长到实验所需密度。细胞分为对照组和实验组，对照组细胞不加A β25-35、实验组细胞加入10μmol/L A β25-35，作用48h时吸尽培养液，4%多聚甲醛固定，4℃保存备用。

1.3.1 PC12细胞凋亡的检测：采用Hoechst 33258核染色的方法检测细胞凋亡情况，荧光显微镜下观察，细胞核呈荧光增强且发白为阳性反应细胞（凋亡细胞）。每组选取3张爬片，每张爬片随机选取5个不重复的视野，在400倍显微镜下计数每个视野中核发白细胞数的百分率，取平均值。

1.3.2 Bcl-2和Bax蛋白表达的检测：采用免疫细胞化学染色法检测PC12细胞Bcl-2（1：100）和Bax（1：100）蛋白的表达情况，DAB显色，苏木素复染。每组选取3张爬片，每张爬片随机选取3个不重复的视野，400倍镜下，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统分析阳性细胞平均光密度值，作为目的蛋白的相对表达水平。

1.4 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，组间计量资料的比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PC12细胞凋亡情况 对照组细胞的胞核呈蓝色，仅个别细胞的胞核颜色发白；实验组细胞胞核浓染且发白，颗粒状荧光团块增多。与对照组相比，实验组PC12细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见附表：

附表 PC12细胞凋亡情况和Bcl-2、Bax蛋白的表达情况

2.2 PC12细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达情况 PC12细胞Bcl-2阳性反应为胞浆棕黄色着色，Bax阳性反应为胞核棕黄色着色。与对照组相比，实验组细胞Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达和Bax/Bcl-2比值明显升高（P＜0.05）。见附表，图1-2。

图1 各组细胞Bcl-2蛋白的表达（A.对照组，B.实验组）

3 讨论

凋亡是AD病程中神经元大量丢失的主要原因，其中Aβ可诱导神经细胞凋亡，但具体机制尚不明确［4］。本研究采用PC12细胞和10μmol/L A β25-35共孵育48h建立经典AD体外模型，发现与未加A β25-35的对照组比较，实验组PC12细胞凋亡率明显升高。

Bcl-2和Bax是存在于线粒体膜上的一对互相拮抗的细胞凋亡因子，前者通过降低线粒体膜的通透性减少细胞色素C的释放来抑制细胞凋亡，后者在正常情况下以单体形式存在于线粒体膜上，接受凋亡信息时形成二聚体促进细胞色素C释放，促进细胞凋亡。本研究发现，10μmol/L A β25-35与PC12细胞共孵育48h后，在细胞凋亡率明显升高的同时，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低、促凋亡蛋白Bax蛋白的表达明显升高，提示A β诱导细胞凋亡可能与下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达有关。另有研究发现，Bax/Bcl-2比值是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，该比值直接决定了线粒体膜的通透性，从而决定细胞是否存活［5-6］。许维澄等研究发现，上调Bax蛋白的表达水平以及Bax/Bcl-2比值增大可诱导神经元凋亡［7］。本研究亦发现，10μ mol/L A β25-35与PC12细胞共孵育48h的实验组细胞，Bax/Bcl-2比值明显高于未加A β的对照组细胞。

综上所述，10 μ mol/L A β25-35能够诱导PC12细胞凋亡，其机制可能是下调Bcl-2表达、上调Bax表达。因此，寻找可上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达，降低Bax/ Bcl-2比值的靶向药物，将对抑制神经元凋亡，延缓AD病程的发展具有重要意义。

图2 各组细胞Bax蛋白的表达（A.对照组，B.实验组）

［1］Miguel-Hidalgo JJ， Paul IA， Wanzo V， et al. Memantine prevents cognitive impairment and reduces Bcl-2 and caspase 8 immunoreactivity in rats injected with amyloid β1-40［J］. Eur J Pharmacol， 2012， 692（1-3）: 38-45.

［2］Xu J， Zhang R， Zuo P， et al. Aggravation effect of isof lurane on Aβ（25-35）-induced apoptosis and tau hyperphosphorylation in PC12 cells［J］. Cell Mol Neurobiol， 2012， 32（8）: 1343-1351.

［3］程为平，张洋，马莉，等.中药益气活血养脑法治疗老年性痴呆的基础研究［J］.中医药学报，2008，36（3）：19-21.

［4］黄涛波，吕诚，胡小令，等.β-淀粉样蛋白所致神经细胞凋亡在阿尔茨海默病中的作用［J］.实用临床医学，2010，11（6）：127-130.

［5］尚振德，张相彤，谢春成.葛根素对创伤性脑损伤神经细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2012，11（2）：105-108.

［6］王卫东，陈正堂.Bcl-2/Bax比率与细胞“命运”［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2007，14（4）：393-396.

［7］许维澄，林小雯，王群波，等.高浓度医用臭氧对大鼠运动功能和脊髓Bax、Bcl-2表达的影响［J］.中国疼痛医学杂志，2013，19（2）：95-97.

EFFECTS OF AMYLOID BETA-PROTEIN（25-35）ON APOPTOTIC PROTEIN BCL-2 AND BAX EXPRESSION IN PC12 CELLS

ZHANG Mei， DI Ting-ting， WANG Rui-ting
（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To explore the effects of amyloid beta-protein（25-35）on Bcl-2 and Bax expression in PC12 cell. Methods: Alzheimer's disease cells model was made by culturing the PC12 cells with 10μmol/L Aβ25-35for 48 hours. Hoechst 33258 method was used to detect the apotosis of PC12 cells， and immunocytochemical stain was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax protein in PC cells. Results: Compared with control group， the Bcl-2 expression in PC12 cells of experimental group decreased obviously， while the apoptosis rate， Bax expression and Bax/Bcl-2 increased obviously （P＜0.05）. Conclusions: The mechanisms of PC12 cells apoptosis induced by Aβ25-35may be related to downregulation of Bcl-2 expression and up-regulation of Bax expression.

Amyloid beta-protein； PC12 cell； Apoptosis； Bcl-2； Bax

R966

A

1004-6879（2016）02-093-03

* 河北省教育厅重点资助课题（ZD20131051），河北省中医药抗痴呆重点研究室建设项目（20142803），河北省高校重点学科资助项目

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（20 15-09-24）