酪氨酸酶抑制法与斑马鱼评价模型的比较研究

陈健敏，余晓静，黄梅萍，黄玉凤

(莆田学院 药学与医学技术学院，福建 莆田 351100)



酪氨酸酶抑制法与斑马鱼评价模型的比较研究

陈健敏，余晓静，黄梅萍，黄玉凤

(莆田学院 药学与医学技术学院，福建 莆田 351100)

传统的酪氨酸酶抑制法与新型的斑马鱼评价模型之间是否存在优势互补，斑马鱼模型是否具有广泛适用性，这两个问题对美白剂评价方法的发展具有较大的意义.采用酪氨酸酶抑制法和斑马鱼评价模型同时评价常用美白剂包括曲酸、熊果苷、抗坏血酸、光甘草定和氢醌的美白作用.结果证明，用这两种方法评价曲酸和熊果苷都呈现阳性反应，说明两种方法具有一致性；但是，抗坏血酸和光甘草定在酪氨酸酶活性抑制法中显示出抑制作用，但对斑马鱼色素的形成并没有明显的抑制，这又说明两种方法具有矛盾性.酪氨酸酶抑制法能够阐述美白作用的机制包括单酚酶抑制和双酚酶抑制，而斑马鱼评价模型却能够评价美白剂的安全性包括致畸率和死亡率.总之，两种评价方法各具优缺点，两种方法的联合应用能够在美白剂的评价上实现优势互补.

酪氨酸酶；抑制作用；美白剂；斑马鱼

目前美白剂功效的评价方法主要包括酪氨酸酶抑制法、细胞生物学法、动物实验法和人体试验法.酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成[1].酪氨酸酶抑制法通常就是用于测定美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率,且测定时间短，操作简便，所需费用低,适用于对美白剂进行大通量筛选[2].该法虽然简单快捷，但不能反映美白剂能否到达有效作用位点，也无法反映美白剂的其他作用机制，所以存在一定的局限性.在筛选和评价备选化合物美白活性阶段，需要大量的实验，用哺乳动物模型或人体试验虽然能够得到较为可靠的数据，但费用高昂且周期较长[3].为此，迫切需要开发新的方法，以达到简单、快速、廉价并准确地评价美白剂功效的目的.

斑马鱼是一种小型热带鱼,由于具有易饲养、生长发育快、给药简单、繁殖能力强、易于活体观察等优点，并与人类基因相似度高达87%，许多器官和系统的早期发育与人类极为相似，已成为研究人类相关疾病的重要模式生物之一[4-6].斑马鱼身体表面的色斑特征是由3种色素细胞产生，在受精卵发育24 h左右就可看见皮肤色素的斑点[7-8].鉴于斑马鱼色素形成过程较快速、小分子渗透性好、操作简单等优点，Choi等[10]于2007年首次提出利用斑马鱼作为美白剂的评价模型[9].利用斑马鱼作为评价模型已经发现熊果苷、熊果苷的衍生物[11]、连翘环己醇酮[12]、覆盆子酮[13]和苯乙酮衍生物[14]等均能够抑制斑马鱼色素的形成，可以作为潜在的美白剂.

然而，斑马鱼评价模型是否能够完全取代酪氨酸酶抑制法，是否也存在着一定的局限性，这些问题的解决对美白剂评价方法的发展具有重要意义.为此，笔者选取了常用的美白剂，包括曲酸、熊果苷、抗坏血酸、光甘草定和氢醌，同时采用酪氨酸酶抑制法和斑马鱼评价模型对其美白功效进行评价，拟找出两种方法各自的优势和不足，为美白剂评价方法的发展提供一定的数据支持.

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

试剂：抗坏血酸购于Sigma-Aldrich 公司；光甘草定(纯度为98.5%)购于成都普思生物科技有限公司；酪氨酸酶(来源于蘑菇，比活力为500 U·mg-1)，左旋多巴、酪氨酸、氢醌、α-熊果苷和曲酸均购自上海晶纯生化科技股份有限公司；实验中的其他试剂均为分析纯.

仪器：UV2550 紫外可见分光光度计，日本岛津； PHS-3C 型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司； SK2500TSH体视显微镜，深圳赛克数码科技开发有限公司.

实验动物：实验用成年斑马鱼( 购于中国科学院水生生物研究所，武汉) 饲养于实验室养殖系统中，饲养条件为：28.5 ℃恒温，人工控制光/暗周期为：14/10 h.

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

酪氨酸酶用0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH=6.8)配制，单酚酶活性测试时浓度为1 000 U·mg-1，双酚酶活性测试时浓度为400 U·mg-1.酪氨酸酶抑制法中：水溶性美白剂用蒸馏水作为溶剂，而油溶性美白剂用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂，现配现用.胚胎培养液：母液A(盐水)：4 g海盐，加蒸馏水于100 mL容量瓶定容；母液B(亚甲基蓝)：0.1 g亚甲基蓝，加蒸馏水于100 mL容量瓶定容；取150 μL母液A,加25 μL母液B，加蒸馏水于100 mL容量瓶定容，即得胚胎培养液.斑马鱼评价模型中：水溶性美白剂用胚胎培养液作为溶剂，而油溶性美白剂用含1% DMSO的胚胎培养液作为溶剂，现配现用.

1.2.2 酪氨酸酶抑制法

[15]的方法并做修改.测定双酚酶活性时以0.5 mmol·L-1多巴为底物，测定酪氨酸酶单酚酶活性时以0.5 mmol·L-1的酪氨酸作为底物，均用0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH=6.8)配制.取试管A1、A2、A3，分别加入2.8 mL底物溶液，28 ℃预热10 min后，A2和A3加入100 μL美白剂溶液，A1加入等体积蒸馏水或DMSO.混匀后，A1、A2加入100 μL酪氨酸酶溶液，A3加入100 μL磷酸缓冲溶液，摇匀，反应10 min时测定A475，平行测定3次.根据公式：酶活性(%)=[(A2-A3)/A1]×100% 计算出相应抑制剂下的酶活性.(A1：底物，酪氨酸酶在样品溶剂存在下反应10 min的吸光度值；A2:底物，酪氨酸酶在抑制剂存在下反应10 min的吸光度值；A3：底物，抑制剂反应10 min的吸光度值).对于单酚酶活性测试，美白剂若具有双酚酶活性，仅用上述方法不能测定单酚酶抑制作用.只能采用以下方法，美白剂(不同浓度)与酪氨酸酶分别加入预热10 min的酪氨酸溶液中，随着时间变化记录吸光度值的变化，前2 min内每0.5 min记录1次，之后1 min记录1次，直至30 min，然后绘制以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标的关系图，从图中得到酶反应的迟滞时间和曲线斜率的变化，从而判断美白剂是否具有单酚酶抑制作用.

1.2.3 斑马鱼评价方法

斑马鱼的繁殖参照文献[16]的方法.取卵前一日，雌雄鱼分开，第2天光照开始前将雌雄鱼( 1∶2) 并池，约1 h后，开始收集胚胎.将收集的胚胎充分清洗后，挑选发育正常的胚胎，加入胚胎培养液，于28.5 ℃培养箱中培养9 h.用塑料吸管把胚胎收集到24孔板上，每孔加入1 mL美白剂溶液、10个胚胎.以胚胎培养液作为阴性对照，以0.25 mmol·L-1的苯硫脲溶液作为阳性对照，培养24 h后更换相应的溶液.继续培养24 h后，在体视显微镜下观察斑马鱼幼鱼体表色素的形成情况，是否畸形，并统计死亡率，从而判断美白剂的美白功效和毒性.

2 结果与讨论

2.1 美白剂对酪氨酸酶双酚酶活性的影响

由于氢醌本身是酪氨酸酶的底物，其氧化产物在475 nm处也有吸收，对试验结果产生干扰，无法利用酪氨酸酶抑制法进行评价，此处测定曲酸、熊果苷、抗坏血酸和光甘草定4种美白剂在不同浓度下对酪氨酸酶双酚酶活性的影响.以美白剂浓度作为横坐标，酪氨酸酶的相对活性作为纵坐标，绘制图1.

图1 美白剂对酪氨酸酶双酚酶活性的影响Fig.1 Effects of whitening agents on diphenolase activity of tyrosinase

从图1a可以看出熊果苷对酪氨酸酶的双酚酶活性没有抑制作用，反而有激活作用，与文献报道的一致[17].曲酸和抗坏血酸对酪氨酸酶表现出较强的抑制作用，而且抑制程度与浓度呈正相关，从图1a中计算出导致酶活力下降一半所需的抑制剂曲酸和抗坏血酸的浓度(IC50)分别为75.74,111.47 μmol·L-1.从图1b可以看出光甘草定在低浓度下就对酪氨酸酶双酚酶活性表现出较强的抑制作用，IC50为0.43 μmol·L-1，抑制作用是曲酸的176倍.结果表明，利用酪氨酸酶双酚酶抑制试验可以评价曲酸、抗坏血酸和光甘草定的美白功效，并能够通过IC50进行定量比较.

2.2 美白剂对酪氨酸酶单酚酶活性的影响

从图1a可以看出熊果苷对于酪氨酸酶双酚酶活性没有抑制作用，但是熊果苷是高级化妆品中常用的美白剂，临床上显示出美白作用[18]，因此考察其对酪氨酸酶单酚酶活性的影响，结果如图2a所示.对于曲酸和光甘草定来说，由于二者本身就有双酚酶抑制能力，就不能简单地利用酪氨酸作为底物，若通过吸光度值A475的高低来判断抑制率，结果会受到双酚酶抑制的影响.在这种情况下，通常是利用反应时间与吸光度值关系图中的迟滞时间是否增加和曲线斜率是否变化来判断是否具有单酚酶活性[19].绘制在不同浓度的曲酸和光甘草定下，时间与吸光度的变化关系图，结果如图2a～b所示.氢醌本身是酪氨酸酶的底物，抗坏血酸的机制已基本明确，此处不再探讨.

图2a所示结果证明熊果苷具有较强的单酚酶抑制作用.从图2b可以看出，曲酸浓度范围从0增加到41.33 μmol·L-1，酶反应的迟滞时间从1.44 min逐渐增加到10.03 min，说明曲酸具有单酚酶活性抑制作用.而图2c则表明，光甘草定浓度范围从0增加到0.325 μmol·L-1，酶反应的迟滞时间保持在1.47 min左右，说明光甘草定并不影响反应的迟滞时间，但具有单酚酶活性抑制作用.

图2 美白剂对酪氨酸酶单酚酶活性的影响Fig.2 Effects of whitening agents on monophenolase activity of tyrosinase

2.3 美白剂对斑马鱼色素形成及存活率的影响

美白剂对斑马鱼色素形成的影响结果如图3所示.

图3 美白剂对斑马鱼色素形成的影响Fig.3 Effects of whitening agents on the pigmentation of zebrafish embryo

从图3可以明显看出，阴性对照，即用胚胎培养液或含1% DMSO的胚胎培养液，培养的斑马鱼幼鱼体表有明显的色素斑点，而且体态正常，无畸变.阳性对照，即加入0.25 mmol·L-1苯硫脲，培养的斑马鱼幼鱼体表没有色素斑点，体态正常.以上结果说明斑马鱼评价模型建立成功.熊果苷和曲酸从左至右，浓度分别为0.010，0.10，1.0，20，50 mmol·L-1与0.10，1.0，5.0，20，50 mmol·L-1，可以发现随着美白剂浓度的增大，斑马鱼体表的色素逐渐减少，而且浓度较高时，发现斑马鱼发生畸变.从图3中可以直观地看出，熊果苷相对于曲酸来说，对斑马鱼色素具有更强的抑制作用.抗坏血酸从左至右浓度从0.020 mmol·L-1增大到1.0 mmol·L-1，光甘草定从0.013 mmol·L-1增大到0.20 mmol·L-1，但是观察不到明显的色素抑制作用，抗坏血酸的结果与文献报道一致[20].对于光甘草定来说，还发现浓度较低时，仍然能使胚胎发生畸变.氢醌浓度从左至右分别为0.030，0.060，0.12，0.24，0.48 mmol·L-1，随着浓度的增大，对斑马鱼色素抑制作用逐渐增强.对比熊果苷的数据可以发现，氢醌的浓度较低时就能够起到抑制作用，说明美白作用更强，在0.48 mmol·L-1的浓度下就能致畸变，而熊果苷在5.0 mmol·L-1时，斑马鱼体态正常，说明氢醌致畸性强.

斑马鱼体态是否畸变只是考察美白剂毒性的一个方面，另一个重要方面是考察斑马鱼胚胎的死亡率，可以进一步比较美白剂的毒性大小，美白剂对斑马鱼胚胎死亡率的影响结果列于表1.

表1 美白剂对斑马鱼胚胎死亡率的影响

由表1的阴性对照可以看出，含有1% DMSO的培养液会对胚胎死亡率产生一定的影响.比较熊果苷和曲酸的死亡率，发现熊果苷的毒性更强，胚胎死亡数均高于相当浓度的曲酸.低浓度有致畸作用的氢醌在不同浓度时引起的胚胎死亡率为0%，这说明低浓度氢醌虽然有较强的致畸作用，但是相对于熊果苷来说，死亡率更低.抗坏血酸在1.0 mmol·L-1时胚胎死亡率达到60%，而光甘草定在低浓度下就有较高的致死率，这可能与其溶剂(含1% DMSO)有关.结果表明斑马鱼评价模型不仅能够直观地观察到美白剂的美白作用，而且能够对美白剂的安全性进行比较分析.

2.4 两种美白剂评价方法的比较分析

酪氨酸酶抑制法能够定量地测定IC50，从而比较不同美白剂的美白活性大小，而且能阐明美白剂是否是通过抑制酪氨酸酶活性而实现美白作用的，有利于研究美白剂作用的机制.比如研究结果发现熊果苷对双酚酶活性没有抑制，而对单酚酶活性有抑制，说明熊果苷美白活性源自单酚酶抑制能力.它的缺点在于不能直观地比较美白剂的活性，要看懂相关数据，需要一定的专业背景.斑马鱼评价模型的优点之一在于能够十分直观地观察美白剂是否对色素产生抑制，通过观察美白剂对色素抑制的程度可以判断美白剂的活性大小，比如从图3就可以直接看出熊果苷等美白剂的美白作用，但是缺少定量依据.另外，可以通过斑马鱼的畸变率和死亡率来比较美白剂的致畸性和毒性，评价美白剂的安全性.两种方法均操作简单，试验成本低，周期短，适合高通量筛选美白剂.

两种方法之间是否存在优势互补，从实验数据也可窥见一斑.对于熊果苷和曲酸这两种常用的美白剂，在酪氨酸酶抑制法中都表现出对酪氨酸酶有较强的抑制作用，而且都对斑马鱼色素产生抑制，这说明两种方法具有一致性.但是，对于抗坏血酸和光甘草定来说，二者均具有抑制酪氨酸酶活性的作用，但是均不能抑制斑马鱼色素的生成，这说明这两种方法又有矛盾的地方.而且抗坏血酸和光甘草定作为常用的美白剂，已经在临床上证明其具有美白作用[21]，因此斑马鱼模型具有一定的局限性.氢醌作为传统的美白剂，能够有效地抑制斑马鱼色素的生成，但是却难以利用酪氨酸酶抑制法测定其抑制能力，因为其酶催化的产物本身也具有颜色，会干扰测定，这说明了酪氨酸酶抑制法也具有一定的局限性.两种评价方法均具有一定的优点和不足，各自的优点恰能弥补对方的不足，所以结合两种方法来评价美白剂的功效和安全性具有巨大的优势.

3 结束语

笔者采用两种美白剂评价方法对常用的美白剂(曲酸、熊果苷、抗坏血酸、光甘草定和氢醌)进行美白功效的评价，比较两种方法的优势和不足.结果表明，酪氨酸酶抑制法简单方便、能提供定量的数据来判断美白剂的作用，而且能够阐述美白作用机制；斑马鱼模型能够直观地通过观察得出美白功效，而且能够对美白剂的安全性进行评价.对于一部分的美白剂来说，两种方法评价的结果是一致的，但是对于某些美白剂来说，评价的结果并不一致，说明两种方法都具有一定的局限性.联用两种方法，使之形成优势互补，能够更加客观、准确地评价美白剂的功效和安全性.

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(责任编辑 于 敏)

Comparative studies of enzymatic assays and zebrafish system for evaluating whitening agents

CHEN Jianmin,YU Xiaojing,HUANG Meiping,HUANG Yufeng

(College of Pharmaceutical and Medical Technology,Putian University,Putian 351100,China)

The relationship between novel zebrafish system and traditional enzymatic assays is still unknown,and the general applicability of the results obtained from zebrafish system is debatable.It is of great significance in working out these issues for development of methods for evaluating whitening agents.In this study,the authors tested commonly used whitening agents including kojic acid,arbutin,ascorbic acid,glabridin and hydroquinone using both enzymatic assays and zebrafish system.The results demonstrated that both kojic acid and arbutin presented positive reaction using the methods,which proved the methods had good agreement.However,inconsistent results were also observed in the methods.Ascorbic acid and glabridin both showed inhibitory effects in enzymatic assays,but no inhibitory effects on the pigmentation of zebrafish.Enzymatic assays could be used to explain the mechanism of whitening agents,while zebrafish system could provide the data of safety.In conclusion，each of these methods presented advantages and disadvantages,and it was suggested that combination of both methods would be complemental in superiority for evaluating whitening agents.

tyrosinase;inhibitory effects;whitening agents;zebrafish

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.06.013

2016-01-18

福建省自然科学基金资助项目(2015J05167)；莆田市科技计划项目(2014S02(1))；国家级大学生创新项目(201411498013，201511498014)；福建省大学生创新项目(201511498052)

陈健敏(1985-),男，福建龙岩人，莆田学院讲师，博士.

Q554.1

A

1000-2162(2016)06-0073-07