生物杀虫剂-昆虫病原线虫的培养技术

颜 珣，韩日畴

(广东省生物资源应用研究所，广东省农业害虫综合治理重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260)



生物杀虫剂-昆虫病原线虫的培养技术

颜 珣，韩日畴*

(广东省生物资源应用研究所，广东省农业害虫综合治理重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260)

昆虫病原线虫是新型的生物杀虫剂，对钻蛀及土栖性害虫防效较好，具有部分替代化学农药的潜力。昆虫病原线虫的产业化培养是昆虫病原线虫商业化应用的基础。本文介绍了目前世界上常用的昆虫病原线虫的培养方法，包括活体培养、半固体培养和液体培养的技术，这些技术的应用有助于昆虫病原线虫的种质保存及培养，为拓展昆虫病原线虫的产业化生产和应用奠定了基础。

昆虫病原线虫；大量培养；昆虫活体培养；体外固体培养；体外液体培养

昆虫病原斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis线虫是国际上新型的高效生物杀虫剂(Georgisetal.，2006)，从二十世纪30年代开始就被用于害虫的防治(Smart，1995)，具有杀虫能力强，杀虫谱广，能主动搜索寄主，对人畜、环境安全等优点，易于大量培养及配制产品，并能与多种化学农药混用，对钻蛀及地下害虫有特效(颜珣等，2014)。

昆虫病原线虫的生活史起始于感染期幼虫(Infective juveniles，IJ)携带共生细菌进入寄主昆虫活体，感染期幼虫避开昆虫的免疫反应，在昆虫血淋巴内释放共生细菌(Dowds and Peters，2002)。共生细菌在昆虫血淋巴内增殖，杀死寄主昆虫，线虫取食共生细菌以繁殖。当昆虫活体营养耗尽，3龄耐受态感染期幼虫形成，在外界环境足够湿润且温度适宜时，感染期幼虫携带共生细菌离开寄主昆虫(Brown and Gaugler，1997)，搜寻新的寄主。感染期幼虫是昆虫病原线虫生活史中唯一能自由存活的龄期，可使用普通的喷雾器进行施用以防治害虫。感染期幼虫能存活1到多个月，可进行产业化培养(Wrightetal.，2005)。

昆虫病原线虫的产业化培养是昆虫病原线虫推广及商业化应用的基础。昆虫病原线虫可以通过寄主昆虫进行活体培养，亦可以在体外通过固体培养基培养或用发酵罐进行液体培养。昆虫病原线虫的体外培养需要共生细菌的参与，共生细菌可将培养基中的营养物质转化成昆虫病原线虫生长发育繁殖所需的成分(Dowds and Peters，2002)。进行昆虫病原线虫的产业化培养时，液体培养是最合算的，但是固体培养和活体培养同样重要，固体培养在劳动力便宜的国家和地区更为适用，因为所需要的前期投入少；活体培养则适合于实验室内种质保存及小量实验。这3种培养技术的详细介绍如下。

1 昆虫活体培养

昆虫寄主活体培养是早期昆虫病原线虫应用的培养方式，1970年就开始有公司用大蜡螟Galleriamellonella生产昆虫病原线虫。从十九世纪80年代开始，有多种线虫是应用寄主昆虫进行大量生产并销售的(Poinar and Grewal，2012)。在昆虫病原线虫体外培养技术发展起来之前，活体培养适宜小批量生产昆虫病原线虫，目前仍适合小作坊。

寄主活体培养昆虫病原线虫的策略是使用敏感、可靠又相对便宜的昆虫寄主来培养昆虫病原线虫。与其他寄主昆虫相比，大蜡螟对大部分昆虫病原线虫品种敏感，生产厂家较多，每条大蜡螟的产量可达到1-3.5×105头感染期幼虫，是目前最理想的可用于昆虫病原线虫活体培养的寄主昆虫(Dutkyetal.，1964；Milstead and Poinar，1978)。但有些昆虫病原线虫品种在大蜡螟活体无法繁殖，则可用黄粉虫Tenebriomolitor、金龟子或者其他直翅目昆虫来培养(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。活体培养包括线虫接种、线虫收集、线虫清洗及收获等步骤。

1.1 培养技术

接种线虫可以通过喷雾器喷线虫悬液，或者将寄主昆虫浸泡在线虫液中，而最普遍的方法是将线虫接种到昆虫上。寄主昆虫的密度和接种量需根据不同的线虫及寄主昆虫的品种进行优化，剂量过低，寄主死亡率低，剂量过高，会因为与二次入侵的感染期幼虫之间产生竞争而导致感染失败(Woodring and Kaya，1988；Shapiro-Ilanetal.，2002)，因此有必要选择合适的接种量以获得最高的产量。以大蜡螟为寄主时，一般是25-200 IJ每头虫的接种量，而以黄粉虫为寄主时，一般是100-6000 IJ每头虫的接种量(Boffetal.，2000)。此外，寄主过多拥挤时会导致缺氧及产生大量的氨气，从而影响线虫的产量(Shapiro-Ilanetal.，2002)。

活体培养的线虫是以White(1972)建立的方法为原理进行收集的，称为水诱集法(White trap)。水诱集法包含一个容器放置昆虫病原线虫致死的虫尸，这个容器放置于另一个更大的容器中，形成一个小岛，底部浸泡在水中，感染期幼虫爬出虫尸后爬入水中，方便收集。基本上目前所有实验室都用改良过的水诱集法来收集培养的昆虫病原线虫(Lindegrenetal.，1993)。Carne and Reed(1964)发明的一种收集线虫的自动装置，是将感染的虫尸放置于一个碟子上，碟子上留有一个缺口连接着漏斗，容器内的水通过自动装置稳定在刚好接触虫尸的水平。当线虫从虫尸爬出碟子时，沉降到漏斗的底部，打开活塞即可收集线虫。

收集的感染期幼虫必须进行清洗和浓缩，将线虫与虫尸残留物、细菌和其他龄期分开，以避免其他微生物的污染从而缩短货架时间。通常是将收集的线虫液通过一层滤膜，感染期幼虫爬过滤膜，其他物质则保留在滤膜上(Gaugler and Brown，2001)。Shapiro-Ilan等(2014a)介绍了一种单一容器的设计，将被线虫感染的虫尸直接放置于用于剂型配制的介质上，存放于最终的包装中，感染期幼虫一爬出就移除虫尸，制成的线虫剂型产品就可以直接用于运输或储存。这种流水线式的方法，免除了额外的浓缩和包装的步骤，使线虫一孵出就能直接被做成剂型并包装。另外一种活体培养的流水线方法是直接生产和应用昆虫病原线虫感染的寄主昆虫。这种方法直接将昆虫病原线虫感染的寄主虫尸施放到田间，线虫孵出后直接于田间防控害虫，减少了收集和浓缩线虫的劳力成本(Shapiro-Ilanetal.，2001)。直接施用昆虫病原线虫感染的寄主虫尸对害虫的防控效果显著(Janssonetal.，1993；Jansson and Lecrone，1994)。研究表明，从虫尸中出来的线虫在土壤中的感染力和扩散力均比通过悬液施用的线虫要强(Shapiro-Ilan and Glazer，1996；Shapiro-Ilan and Lewis，1999)。由于大蜡螟虫尸本身比较脆弱，Shapiro-Ilan 等(2001)人研究用一层淀粉或黏土等作为衣膜包裹虫尸制成虫尸剂，可以提高虫尸的干燥耐性和储存性，阻止虫尸腐烂及粘连。如果寄主昆虫用黄粉虫，由于虫体较硬，且表面平滑，则不容易腐烂或粘连。小区实验表明，线虫用黄粉虫虫尸施用时，防治柑橘象鼻虫Diaprepesabbreviatus和葡萄黑耳喙象Otiorhynchussulcatus的效果好于悬液喷施(Shapiro-Ilanetal.，2003)。

1.2 影响因素

寄主昆虫活体培养的线虫产量受多种因素影响，与寄主大小成正相关，与线虫大小成负相关，但是在选择寄主昆虫及线虫时仍需考虑单头寄主昆虫生产线虫的成本；线虫的产量还与温度、通气及湿度等环境因子有关(Gaugler and Han，2002；Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。用活体培养的方法大量生产线虫时，温度容易控制，但湿度和通气比较难随规模的扩大而保持。温度是培养过程中一个重要参数，会影响产量及线虫收获的时间(Grewaletal.，1994)。使用大蜡螟进行培养的最佳温度在18℃-28℃，根据线虫种类不同而不同：比如耐冷的某些S.feltiae线虫品系最适合于18.5℃培养，耐热品种S.riobrave适合在28℃培养，而S.carpocapsae则适合于25℃培养。除温度外，充足的通气和一定的湿度在培养过程中也是必须的。要确保培养过程中有充足的通气，以防止氨气及其他有害气体的累积(Woodring and Kaya，1988)。湿度必须控制在不饱和与太干之间，湿度饱和会诱导成虫离开虫尸，容易引起真菌和细菌的污染，虫尸容易被蚤蝇幼虫破坏，导致线虫无法生长。为保证湿度，培养系统通常是独立封闭的，但不封实以确保通气，或者用透气膜封口以防治蚤蝇的感染。

1.3 优缺点

昆虫病原线虫的活体培养需要的前期投入中等，操作简单，但产出相对较低，需要饲养昆虫且劳动成本高，适于培养昆虫病原线虫用于实验室内的生物测定等实验，及线虫种质资源的保存和维护。

2 体外人工饲料培养

昆虫病原线虫的感染期幼虫通常是要感应到昆虫血淋巴中的特异化合物后才开始发育。研究表明是昆虫血淋巴内一种热稳定且对蛋白酶不敏感的低分子量化合物启动了感染期幼虫的发育和共生细菌的释放(Cicheetal.，2006)。进行昆虫病原线虫人工体外培养时，如果需要通过加入昆虫血淋巴来诱导线虫发育的话，会比较繁琐，且花费较高。研究发现，共生细菌也能产生一种信号化合物来诱导线虫的发育，但这种信号化合物不稳定，因此在向长好共生细菌的培养基中接入感染期幼虫的时机很重要，以保证获得高产的龄期一致的感染期幼虫(Aumann and Ehlers，2001；Johnigketal.，2004)。

共生细菌不仅诱导感染期幼虫的发育，还为线虫的生长提供食物。昆虫病原线虫在取食其他属或者近源种的细菌时会发育不良，仅取食与之共生的相应的共生细菌才能正常发育，因此有必要在人工培养基上建立并且维持相应共生细菌的单菌培养系统。而活体培养时，寄主昆虫为入侵的线虫提供了一个无菌的环境，一旦线虫释放共生菌，共生菌就为线虫在寄主昆虫血淋巴内建立了一个单菌培养系统(Dowds and Peters，2002；Gouge and Snyder，2006)。

建立单菌培养系统首先必须分离昆虫病原线虫的共生细菌。共生细菌的分离和纯化有两种方法：一种是从线虫致死的寄主昆虫血淋巴内分离共生细菌，一种是将感染期幼虫进行表面消毒后捣烂，从线虫肠道内分离共生细菌。将昆虫血淋巴或捣烂的线虫悬液涂布于NBTA培养基(蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，琼脂粉1.5%，溴百里酚蓝0.025%，红四氮唑0.004%)或MacConkey培养基(胨1.7%，蛋白胨0.3%，乳糖1%，胆盐0.15%，氯化钠0.5%，中性红0.003%，琼脂粉1.35%)(Akhurst，1980)，根据形态和色素挑取单菌再进行纯化。共生细菌有两种型态，只有初生型(I型)的细胞能够支持线虫的生长并被线虫取食(Han and Ehlers，2001)。进行昆虫病原线虫体外培养时，必须确保使用的是初生型的共生细菌，这可以通过NBTA培养基或者MacConkey培养基来鉴别。共生细菌种质可以保存于15%甘油中，置于-80℃的超低温冰箱内长期保存。

获得无菌线虫的方法有两种。第一种是用1%次氯酸钠消毒感染期幼虫后，接种到长好共生细菌的培养基中。这种方法并不总能得到表面无菌的线虫，因为表面消毒有时不能杀死感染期幼虫体表的所有细菌，且容易被真菌污染。第二种方法是消毒线虫的卵：在Ringer’s溶液(0.9% NaCl，0.042% KCl，0.048% CaCl2和0.02% NaHCO3)中将怀卵的大母虫(斯氏属线虫)或者雌雄同体的异小杆线虫捣烂，过滤收集卵，使用消毒液(2.5 mL4 M NaOH，0.5 mL 12% NaOCl和21.5 mL无菌水)表面消毒5 min后清洗，收集卵于LB溶液中孵育到1龄(约2 d)，若无细菌污染，则可以将幼虫接种到长好共生细菌的油脂培养基中(1.6% 营养肉汤，1.2% 琼脂粉和1%玉米油)，在琼脂上建立单菌培养系统。琼脂平板上的单菌线虫可直接用于线虫固体或液体的单菌大量培养(Shapiro-Ilanetal.，2014b)。

2.1 固体培养

Glaser(1940)最早用固体培养基培养昆虫病原线虫用于生物防治，当时共生细菌尚未被认识，线虫仅仅使用狗粮来培养。现代的固体培养是建立在单菌培养的基础上，将感染期幼虫接种到相应的共生细菌的纯培养基中进行培养。昆虫病原线虫的固体培养包括4个步骤：培养基准备、共生细菌的培养和接种、线虫接种及收获。

2.1.1 固体培养技术

最早用于昆虫病原线虫固体培养的培养基是琼脂培养基(Houseetal.，1965；Wouts，1981；Dunphy and Webster，1989)，目前使用最多的是将营养物质与海绵混配的三维培养基来进行昆虫病原线虫的大量培养，该种培养基是由Bedding(1981，1984)最早发明的。Bedding的培养基是将打碎的海绵块与家禽的内脏匀浆混配，由于内脏质量控制难以标准化，容易导致不可预期的结果。因此Wouts(1981)发明了一种用酵母、玉米油、玉米粉和干蛋黄混配的培养基。目前比较通用的改良的海绵培养基配方如下：豆粉15%，面粉5%，玉米油5%，酵母粉1%，蛋黄粉1%，海绵碎10%(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)，此配方由广东省昆虫研究所发明，目前已将该固体培养技术辐射到朝鲜、巴基斯坦、印度尼西亚、卢旺达等发展中国家。用于盛装培养基的容器可以是三角瓶、铁盒或者塑料袋(Beddingetal.，1991；Gaugler and Han，2002)，但必须保证通气。培养基的成分和配比会影响感染期幼虫的产量，需要根据不同品系的昆虫病原线虫对其最适合的培养基进行优化。培养基成分中的脂质含量、水分、酵母粉、蛋黄、猪油、豆粉、盐和蛋白质含量等均会对感染期幼虫的产量产生影响(Dunphy and Webster，1989；Hanetal.，1992；Ehlers and Shapiro-Ilan，2005；Salma and Shahina，2012；Shapiro-Ilanetal.，2014a)。

共生细菌可以用LB培养液(氯化钠0.5%，胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%)或者YS培养液(磷酸氢铵0.05%，磷酸氢钾0.05%，7水合硫酸镁0.02%，氯化钠0.5%，酵母粉0.5%)进行大量培养(Hirao and Ehlers，2009)。新鲜培养的共生细菌接到海绵培养基中，1-4 d后才能接种线虫，因为共生细菌需要时间将培养基中的营养物质转化成适合线虫发育和繁殖的营养物质(Forstetal.，2002)。共生细菌的接种量对线虫产量的影响不大(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)。

在琼脂培养基上建立的单菌培养物可以直接接种到长好共生细菌的海绵培养基中进行扩大培养。接种单菌线虫到海绵培养基中必须在无菌环境中操作，可以直接将长好感染期幼虫的海绵倒入培养基中(使用三角瓶容器)，或者将线虫从海绵培养基中洗出后接种到培养基中(适合铁盆或塑料袋培养)。线虫的接种量会影响一些线虫品系的产量，比如S.carpocapsaeAgriotos线虫的最佳产量是在2000 IJ/g的接种量(Hanetal.，1993)，而S.carpocapsaeCB2B和H.bacteriophoraH06的产量则不受接种量的影响(Hanetal.，1992)。增大接种量可以加速线虫的增殖从而缩短培养时间。

线虫在培养基中培养2-5周后，可以进行收获(Bedding，1981；Bedding，1984)。收集线虫时，将培养基收集在纱网做的袋子中，用洗衣机将线虫洗出，收集洗液后沉淀收集线虫，清洗2次以上以去除杂质，最后用滤布收集线虫泥(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。线虫泥中的杂质如果不通过清洗尽量去除，容易引起真菌或细菌的污染。

2.1.2 影响因素

昆虫病原线虫体外固体培养时，感染期幼虫的产量在不同的昆虫病原线虫品种和品系间会有差异，主要是由线虫本身的繁殖能力和体长决定的。在相同的培养条件下，H.indicaLN2线虫的产量可达9.3×105IJ/g培养基，产量远高于H.bacteriophoraH06线虫(5.1×105IJ/g 培养基)(Shapiro-Ilanetal.，2014b)。

培养温度和培养时间也是重要的参数。获得最大产量的最佳培养温度存在种间及品系间的差异。比如S.carpocapsaeCB2B线虫的最佳培养温度是27℃，H.bacteriophoraH06线虫的最佳培养温度则为25℃，而H.bacteriophora(=heliothidis)线虫在含脂的琼脂培养基上的最佳生长温度为30℃(Hanetal.，1992)。Salma and Shahina(2012)在培养不同品种的巴基斯坦线虫时发现，大部分品种在32℃±2℃时可获得最大产量，而S.feltiae则在20℃±2℃时获得最大产量。一般情况下，延长培养时间可以获得更高的产量，但线虫的死亡率也会随时间的延长而增加(Hanetal.，1992；Hanetal.，1993)。

2.1.3 优缺点

昆虫病原线虫的固体培养要求劳力高，因此在人工成本低的发展中国家应用该培养技术生产昆虫病原线虫比液体培养更加合适(Ehlersetal.，2000)。固体培养具有共生细菌型变的影响小、技术要求低、资本投入低、规模小时失败的风险较低等优点。但是当进行大量培养时，上下游操作容易污染，线虫在培养基中分布不均，不好取样(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。固体培养时培养基高度不能超过20 cm，否则容器底部会因为缺氧而导致线虫无法生长。此外，固体培养的稳定性不高，培养时间较长，生产效率低于液体培养。

2.2 液体培养

Glaser(1940)最早用基于肾脏的液体培养基来培养无菌的S.glaseri。当意识到共生细菌在昆虫病原线虫培养中的重要性后，单菌培养系统随之发展起来。Friedmanetal.(1989)建立了一种基于豆粉、酵母粉、玉米油和蛋黄的培养基，生产的S.carpocapsae产量可达1.1×105IJ/ml。随后，一系列优化的培养基被用于昆虫病原线虫的液体培养，而脂类物质对昆虫病原线虫在液体培养基中生长的重要作用也被逐渐意识到。目前用于昆虫病原线虫液体培养的培养基一般须含有碳源(葡萄糖或甘油)，多种动植物源蛋白，酵母粉及动植物源脂类(Gaugler and Han，2002)。

2.2.1 液体培养技术

液体培养使用的是生物反应器(发酵罐)，发酵罐上有多个探头检测各种理化参数并对温度、pH和溶氧等参数进行监控。各种参数中，通气速率(每分钟通入液体中的无菌空气)和搅拌速率是用来控制溶氧的，pH不调控，仅通过检测pH值以确定共生细菌代谢活性的变化。液体培养的过程如下：首先是将指数生长期的共生细菌纯培养液以0.01%-0.1%的体积比接种到合适的无菌液体培养基中。当共生细菌生长到显示典型的代谢变化时(通常以耗氧量dissolved oxygen和pH值的突然改变为指标)可以接种线虫。几天后线虫发育成成虫，开始产生后代。通常从开始培养算起，3周后即可收集感染期幼虫，有些线虫品种则在2周左右就能获得最大产量(Shapiro-Ilanetal.，2014b )。培养好的感染期幼虫可以通过发酵罐底部的排出阀进行收集、浓缩并配制剂型。

2.2.2 影响因素

感染期幼虫的恢复是液体培养流程中的关键。如果恢复率低，第1代成虫数量少，仅有少部分的共生细菌被取食，则第1代成虫的后代会因为营养充足不能发育成感染期幼虫，而形成成虫。由于此时培养液中的共生细菌质量较差，第2代成虫难以产生后代，所以这个具有两代成虫的培养过程中的感染期幼虫产量会比仅有一代成虫的培养过程中的感染期幼虫产量低(Hirao and Ehlers，2010)。培养时间长，收获时培养液中有高比例的其他龄期的线虫，会缩短最终线虫产品的货架时间。液体培养Heterorhabditis线虫时，低恢复率的影响更为严重，因为第1代的雌雄同体成虫是在液体培养基中唯一能够产生后代的虫龄，第2代的雄虫与雌虫在液体培养环境中会因无法交配而死亡。因此必须控制培养系统，以确保后代来自于第1代的雌雄同体成虫，这就必须引导感染期幼虫恢复一致并发育成雌雄同体成虫，消耗尽培养液中的共生细菌，促使形成一致的感染期幼虫(Johnigketal.，2004)。雌雄同体成虫仅释放一小部分的卵到培养液中，其他卵在母活体孵育并取食卵和母体组织，称为弑母现象(Endotokia matricida)(Johnigk and Ehlers，1999)。在成功的培养系统中，由于没有足够的细菌和营养供给孵化的一龄幼虫，很容易形成感染期幼虫，因此大约在加入感染期幼虫后的10 d即可收获新的感染期幼虫。对Steinernema线虫来说，由于雌雄虫能够在流动的液体中交配，可以耐受液体培养基中的水流及剪切力(Strauchetal.，1994)，产生后代不受影响。

液体培养扩大化的主要瓶颈是共生细菌的质量，要求能够触发感染期幼虫的恢复和发育，并且为线虫提供合适的营养以确保线虫发育一致，从而在培养的最后步骤获得纯的感染期幼虫悬液。共生细菌的型变会影响线虫在液体培养中的产量，次生型共生细菌不能触发线虫的恢复(Han and Ehlers，2001; Hirao and Ehlers，2009)。渗透压、热激以及低氧会导致型变(Krasomil-Osterfeld，1994，1995)。为避免型变，共生细菌必须在相同的培养基中培养，避免扩大培养过程中含氧量的变化。接种线虫之前，必须确保细菌生长到稳定后期。为获得最大的线虫产量，共生细菌的密度必须保证足够高。共生细菌密度低时，S.feltiae和S.carpocapsae的恢复率低(Hirao and Ehlers，2009)。如果第一代成虫取食共生细菌的浓度太低，则大比例的第1代会发育成成虫产生第2代，导致没有足够的共生细菌支持后代的产生。

液体培养过程中的各种参数可以进行优化以提高生产的质量和效率，包括培养基和生物反应动力学的优化(Chavarria-Hernandezetal.，2006;2010)，改善接种量及共生细菌密度(Hirao and Ehlers，2010)，确定最佳接种时间(Johnigketal.，2004)，筛选昆虫病原线虫具有优良性状的品系(Mukukaetal.，2010；Anbesseetal.，2013)以及优化下游的处理等(Youngetal.，2002)。除了溶氧、pH值和温度外，接种线虫的时间和浓度等次要参数也可以进行优化。Johnigk and Ehlers(1999)发现接种线虫的时机对感染期幼虫的恢复率有显著的影响，培养H.bacteriophora线虫时，可在共生细菌预培养过程中pH值最小时加入线虫，使其恢复并取食共生细菌。线虫的恢复依赖于培养基中二氧化碳的浓度，可以通过降低通气和增加罐压来提高二氧化碳的浓度(Jessenetal.，2000)。

2.2.3 优缺点

液体培养的最大优点是规模经济，在大规模生产时劳动力消耗低，易于实现过程控制，保证产品质量，方便清洗以及节省培养空间等(朱明军等，1999)。液体培养的稳定性较好，培养时间相对较短，生产效率高。液体培养的培养单位可以从几毫升扩大到几个平方米，不用增加额外的劳力。但是前期的资本投入高，对技术要求也较高，培养过程比较容易受污染的影响(Ehlers and Shapiro-Ilan，2005)。但是，对Heterorhabditis线虫来说，种质退化可以通过在液体培养来避免，因为在液体培养时，线虫不能交配，因此在最终的培养液中包含了纯合的近交系。有研究表明，液体单菌培养的线虫的毒力高于在活体培养(Anbesseetal.，2013)。

3 小结

昆虫病原线虫产品的质量必须通过标准的生产流程来保证，因此，昆虫病原线虫在培养时必须使用统一的种质培养物。共生细菌可以于-80℃ 或者冻干保存几十年仍可用于生产，但是确保稳定的线虫种质则不容易。少量的线虫可以保存于液氮中，以避免遗传退化(Wang and Grewal，2002)。商业化生产时，遗传变异可以通过在目标昆虫中繁殖昆虫病原线虫再制备无菌线虫来避免。

昆虫病原线虫在生物防治方面的应用离不开高效的大量培养的技术。过去30年间，液体培养的规模扩大已经使成本降低了75%以上，并且将继续降低。因此，昆虫病原线虫也能应用到低价值的作物比如玉米上，而且在欧洲玉米种植地应用昆虫病原线虫，其价格和效率可以与化学农药相比(Toepferetal.，2009)。昆虫病原线虫应用的另一个重要前提是其作为植物保护试剂在许多国家豁免注册，因此线虫生产产业多元化且有多种生产技术共存，这些共存的技术有利于促进技术的创新和可持续发展。根据不同的需求使用不同的技术进行培养及生产，可以克服不同培养技术的局限性，以培养所需要的不同品种的昆虫病原线虫，拓展昆虫病原线虫的应用。

References)

Akhurst RJ. Morphological and functional dimorphism inXenorhabdusspp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes,NeoaplectanaandHeterorhabditis[J].J.Gen.Microbiol., 1980, 121: 303-309.

Anbesse S, Sumaya NH, Dörfler AV,etal. Stabilisation of heat tolerance traits inHeterorhabditisbacteriophorathrough selective breeding and creation of inbred lines in liquid culture[J].Biocontrol, 2013, 58: 85-93.

Aumann J, Ehlers RU. Physico-chemical properties and mode of action of a signal from the symbiotic bacteriumPhotorhabdusluminescensinducing dauer juvenile recovery in the entomopathogenic nematodeHeterorhabditisbacteriophora[J].Nematology, 2001, 3: 849-853.

Bedding RA. Low cost in vitro mass production ofNeoaplectanaandHeterorhabditisspecies (Nematoda) for field control of insect pests[J].Nematologica, 1981, 27: 109-114.

Bedding RA. Large scale production, storage and transport of the insect parasitic nematodesNeoaplectanaspp. andHeterorhabditisspp.[J].Ann.Appl.Biol., 1984, 104: 117-120.

Bedding RA, Stanfield MA, Crompton G. Apparatus and method for rearing nematodes, fungi, tissue cultures and the like, and for harvesting nematodes[P].1991,World Patent,WO 91/15569.

Boff MIC, Wiegers GL, Gerritsen LJM,etal. Development of the entomopathogenic nematodeHeterorhabditismegidisstrain NLH-E 87.3 inGalleriamellonella[J].Nematology, 2000, 2: 303-308.

Brown IM, Gaugler R. Temperature and humidity influence emergence and survival of entomopathogenic nematodes [J].Nematologica, 1997, 43: 363-375.

Carne PB, Reed EM. A simple apparatus for harvesting infective stage nematodes emerging from their insect hosts[J].Parasitology, 1964, 54: 551-553.

Chavarria-Hernandez N, Espino-Garcia JJ, Sanjuan-Galindo R,etal. Monoxenic liquid culture of the entomopathogenic nematodeSteinernemacarpocapsaeusing a culture medium containing whey kinetics and modeling[J].J.Biotechnol., 2006, 125: 75-84.

Chavarria-Hernandez N, Ortega-Morales E, Vargas-Torres A,etal. Submerged monoxenic culture of the entomopathogenic nematode,SteinernemacarpocapsaeCABA01, in a mechanically agitated bioreactor: Evolution of the hydrodynamic and mass transfer conditions[J].Biotechnol.Bioproc.E., 2010, 15: 580-589.

Ciche TA, Darby C, Ehlers RU,etal. Dangerous liaisons: The symbiosis of entomopathogenic nematodes and bacteria[J].Biol.Control, 2006, 38: 22-46.

Dowds BCA, Peters A. Virulence mechanisms. In: Gaugler R, ed., Entomopathogenic Nematology [M]. New York, USA: CABI publishing, 2002, 79-98.

Dunphy GB, Webster JM. The monoxenic culture ofNeoaplectanacarpocapsaeDD-136 andHeterorhabditisheliothidis[J].Rev.Nématol., 1989, 12: 113-123.

Dutky SR, Thompson JV, Cantwell GE. A technique for the mass propagation of the DD-136 nematode [J].J.InsectPathol., 1964, 6: 417-422.

Ehlers RU, Niemann I, Hollmer S,etal. Mass production potential of the bacto-helminthic biocontrol complexHeterorhabditisindica-Photorhabdusluminescens[J].BiocontrolSci.Technol., 2000, 10: 607-616.

Ehlers RU, Shapiro-Ilan-Ilan DI. Mass production. In: Grewal PS, Ehlers RU, Shapiro-Ilan-Ilan DI, eds., Nematodes as Biocontrol Agents[M]. Wallingford, UK: CABI Publishing, 2005, 65-78.

Forst S, Clarke D, Gaugler R. Bacteria-nematode symbiosis. In: Gaugler R, ed., Entomopathogenic Nematology[M]. New York: CABI Publishing, 2002: 57-77.

Friedman MJ, Langston SL, Pollit S. Mass production in liquid culture of insect-killing nematodes[P].1989, World Patent, WO89/04602.

Gaugler R, Brown I. Apparatus and method for mass production of insecticidal nematodes[P]. 2001, US Patent No. 09/533,180.

Gaugler R, Han R. Production technology. In: Gaugler R, ed. Entomopathogenic Nematology[M]. Oxon, UK: CABI Publishing, 2002, 289-310.

Georgis R, Koppenhöfer AM, Lacey LA,etal. Successes and failures in the use of parasitic nematodes for pest control [J].Biol.Control, 2006, 38: 103-123.

Glaser RW. Continued culture of a nematode parasitic in the Japanese beetle[J].J.Exp.Zool., 1940, 84: 1-12.

Gouge DH, Snyder JL. Temporal association of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) and bacteria[J].J.Invertebr.Pathol., 2006, 91: 147-157.

Grewal PS,Selvan S, Gaugler R. Thermal adaptation of entomopathogenic nematodes: Niche breadth for infection, establishment, and reproduction[J].J.ThermalBiology, 1994, 19: 245-253.

Han R, Cao L, Liu X. Relationship between medium composition, inoculum size, temperature and culture time in the yields ofSteinernemaandHeterorhabditisnematodes[J].Fundam.Appl.Nematol., 1992, 15: 223-229.

Han R, Cao L, Liu X. Effects of inoculum size, temperature and time on in-vitro production ofSteinernemacarpocapsaeAgriotos[J].Nematologica, 1993, 39: 366-375.

Han R, Ehlers RU. Effect ofPhotorhabdusluminescensphase variants on theinvivoandinvitrodevelopment and reproduction of the entomopathogenic nematodesHeterorhabditisbacteriophoraandSteinernemacarpocapsae[J].FEMSMicrobiol.Ecol., 2001, 35: 239-247.

Hirao A, Ehlers RU. Influence of cell density and phase variants of bacterial symbionts (Xenorhabdusspp.) on dauer juvenile recovery and development of biocontrol nematodesSteinernemacarpocapsaeandS.feltiae(Nematoda: Rhabditida)[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2009, 84: 77-85.

Hirao A, Ehlers RU. Influence of inoculum density on population dynamics and dauer juvenile yields in liquid culture of biocontrol nematodesSteinernemacarpocapsaeandS.feltiae(Nematoda: Rhabditida)[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2010, 85: 507-515.

House HL, Welch HE, Cleugh TR. Food medium of prepared dog biscuit for the mass-production of the nematode DD-136 (Nematoda: Steinernematidae)[J].Nature, 1965, 206: 847.

Jansson RK, Lecrone SH. Application methods for entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae) aqueous suspensions versus infected cadavers[J].Fla.Entomol., 1994, 77: 281-284.

Jansson RK, Lecrone SH, Gaugler R. Field efficacy and persistence of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae, Heterorhabditidae) for control of sweetpotato weevil (Coleoptera: Apionidae) in southern Florida[J].J.Econ.Entomol., 1993, 86: 1055-1063.

Jessen P, Strauch O, Wyss U,etal. Carbon dioxide triggers dauer juvenile recovery of entomopathogenic nematodes (Heterorhabditisspp.)[J].Nematology, 2000, 2: 319-324.

Johnigk SA, Ecke F, Poehling M,etal. Liquid culture mass production of biocontrol nematodes,Heterorhabditisbacteriophora(Nematoda: Rhabditida): Improved timing of dauer juvenile inoculation[J].Appl.Microbiol.Biotechnol., 2004, 64: 651-658.

Johnigk SA, Ehlers RU. Juvenile development and life cycle ofHeterorhabditisbacteriophoraandH.indica(Nematoda: Heterorhabditidae)[J].Nematology, 1999, 1: 251-260.

Krasomil-Osterfeld K. Phase variation inPhotorhabdus,Xenorhabdusand other bacteria: A review. Genetics of Entomopathogenic Nematode - Bacterium Complexes[M]. European Commission Directorate-General XII, Science, Research and Development Environment Research Programme, Luxembourg, Belgium, 1994: 70-79.

Krasomil-Osterfeld KC. Influence of osmolarity on phase shift inPhotorhabdusluminescens[J].Appl.Environm.Microbiol., 1995, 61: 3748-3749.

Lindegren JE, Valero KA, Mackey BE. Simpleinvivoproduction and storage methods forSteinernemacarpocapsaeinfective juveniles[J].J.Nematol., 1993, 25: 193-197.

Milstead JE, Poinar GO. A new entomophagous nematode for pest management systems [J].Calif.Agric., 1978, 32: 12.

Mukuka J, Strauch O, Hoppe C,etal. Improvement of heat and desiccation tolerance inHeterorhabditisbacteriophorathrough cross-breeding of tolerant strains and successive genetic selection[J].Biocontrol, 2010, 55: 511-521.

Poinar GO, Grewal PS. History of entomopathogenic nematology [J].J.Nematol., 2012, 44: 153-161.

Salma J, Shahina F. Mass production of eight Pakistani strains of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)[J].Pak.J.Nematol., 2012, 30: 1-20.

Shapiro-Ilan DI, Glazer I. Comparison of entomopathogenic nematode dispersal from infected hosts versus aqueous suspension[J].Environ.Entomol., 1996, 25: 1455-1461.

Shapiro-Ilan DI, Gaugler R, Tedders WL,etal. Optimization of inoculation forinvivoproduction of entomopathogenic nematodes[J].J.Nematol., 2002, 34: 343-350.

Shapiro-Ilan DI, Han R, Qiu X. Production of entomopathogenic nematodes. In: Morales-Ramos JA, Rojas MG, Shapiro-Ilan DI, eds. Mass Production of Beneficial Organisms[M]. The Elsevier/Academic Press, 2014b, 321-355.

Shapiro-Ilan DI, Lewis EE. Comparison of entomopathogenic nematode infectivity from infected hosts versus aqueous suspension [J].Environ.Entomol., 1999, 28: 907-911.

Shapiro-Ilan DI, Lewis EE, Behle RW,etal. Formulation of entomopathogenic nematode-infected cadavers[J].J.Invertebr.Pathol., 2001, 78: 17-23.

Shapiro-Ilan DI, Lewis EE, Son Y,etal. Superior efficacy observed in entomopathogenic nematodes applied in infected-host cadavers compared with application in aqueous suspension[J].J.Invertebr.Pathol., 2003, 83: 270-272.

Shapiro-Ilan DI, Tedders WL, Morales-Ramos JA,etal. System and method for producing beneficial parasites[P]. 2014a, US Patent. 1 13/217,956, DN 172.07.

Smart GC. Entomopathogenic nematodes for the biological control of insects [J].SupplementtoJ.Nematol., 1995, 27: 529-534.

Strauch O, Stoessel S, Ehlers RU. Culture conditions define automictic or amphimictic reproduction in entomopathogenic rhabditid nematodes of the genusHeterorhabditis[J].Fundam.Appl.Nematol., 1994, 17: 575-582.

Toepfer S, Burger S, Ehlers RU,etal. Controlling western corn rootworm larvae with entomopathogenic nematodes: Effect of application techniques on plant-scale efficacy[J].J.Appl.Entomol., 2009, 134: 467-480.

Wang X, Grewal PS. Rapid genetic deterioration of environmental tolerance and reproductive potential of an entomopathogenic nematode during laboratory maintenance[J].Biol.Control, 2002, 23: 71-78.

White GF. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures[J].Science, 1927, 66: 302-303.

Woodring JL, Kaya HK. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Techniques[M]. Arkansas Agricultural Experiment Station, Fayetteville, Arkansas,1988.

Wouts WM. Mass production of the entomogenous nematodeHeterorhabditisheliothidis(Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media[J].J.Nematol., 1981, 13: 467-469.

Wright DJ, Peters A, Schroer S,etal. Application technology. In: Grewal PS, Shapiro-Ilan DI, Ehlers RU, eds. Nematodes as Biocontrol Agents[M]. Wallingford, UK: CABI Publishing, 2005: 91-106.

Yan X, Guo WX, Zhao GY,etal. Research advances in subterranean pest control by entomopathogenic nematodes[J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2014, 36: 1018-1024. [颜珣, 郭文秀, 赵国玉, 等. 昆虫病原线虫防治地下害虫的研究进展[J]. 环境昆虫学报, 2014, 36: 1018-1024]

Young JM, Dunnill P, Pearce JD. Separation characteristics of liquid nematode cultures and the design of recovery operations[J].Biotechnol.Prog., 2002, 18: 29-35.

Zhu MJ, Han RC, Wu ZQ,etal. The ementary research on the liquid culture of entomopathogenic nematodesSteinernemain bioreactors [J].JournalofSouthChinaUniversityofTechnology(Nat. Sci. Ed.), 1999, 27: 83-87. [朱明军, 韩日畴, 吴振强, 等. 斯氏线虫生物反应器液体培养的初步研究[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 1999, 27: 83-87]

Production technology of the bio-insecticides: Entomopathogenic nematodes

YAN Xun，HAN Ri-Chou*

(Guangdong Key Laboratory of Integrated Pest Management in Agriculture & Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization，Guangdong Institute of Applied Biological Resources，Guangzhou 510260，China)

Entomopathogenic nematodes are biological control agents that can be used to effectively control boring and subterranean insect pests. Mass production is a prerequisite for the successful commercialisation of entomopathogenic nematodes. The different production techniques, includinginvivoandinvitromethods, are described in the present paper. The application of the production techniques is the basis of nematode stock preservation and mass production, which will explore the industrial production and commercialisation of entomopathogenic nematodes.

Entomopathogenic nematodes；mass production；invivoculture；invitrosolid culture；invitroliquid culture

广东省省级科技计划项目(2014A020208075,2016A020210076)；广东省科学院广州市珠江科技新星专项(2013J2200090)；广东省科学院项目(2016GDASPT-0305，rcjj201201)

颜珣，女，1980年生，广东省汕头人，博士，副研究员，主要从事昆虫病原线虫及其应用研究，E-mail: yanxun@giabr.gd.cn

*通讯作者Authors for correspondence，E-mail: hanrc@giabr.gd.cn

Received：2015-11-03；接受日期Accepted：2016-02-27

Q965；S476

A

1674-0858(2016)05-1044-08