Cyr61及MMP-3/TIMP-2在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达①

王淑静，李春玉，邹艳红，聂 磊，韩小唯，王丽敏

(佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003)



Cyr61及MMP-3/TIMP-2在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达①

王淑静，李春玉，邹艳红，聂 磊，韩小唯，王丽敏

(佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003)

目的：观察单侧输尿管梗阻大鼠(UUO)肾组织中富含半胱氨酸61(Cyr61)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)/金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)的相关性，探讨Cyr61在肾间质纤维化过程中的作用。方法：将80只雄性SD幼年大鼠，随机分为假手术组和模型组，结扎模型组大鼠左侧输尿管并离断致UUO模型。分别在术后第1、3、7、14天每组每次各处死10只大鼠，取左肾标本，做HE和Masson染色，并用免疫组化SABC法检测肾组织中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表达。结果：免疫组化的结果显示在UUO模型大鼠肾组织中Cyr61在肾损伤初期大量表达，同时Cyr61与MMP-3/TIMP-2比值呈正相关(r=0.890,P<0.05)。结论：Cyr61在肾损伤的早期即发挥一定的保护作用，同时这种保护作用在MMP-3/TIMP-2比例的失衡中可能具有重要的调节的作用。

肾间质纤维化；富含半胱氨酸61；基质金属蛋白酶-3；金属蛋白酶组织抑制物-2

Cyr61(Cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)作为整合素的配体，是抗纤维化中重要的一个环节[1]。它可以诱导MMPs的表达，抑制TIMPs的生成。国内Cyr61的研究主要集中在肝纤维化、多囊肾、缺血性肾损伤、肾炎以及其对肾小管上皮细胞凋亡的影响[1，3，4]，而检测其在单侧输尿管梗阻大鼠(unilateral ureteral obstruction,UUO)中的表达及其与MMP—3/TIMP—2相关性的研究尚未见报道，本实验通过结扎单侧输尿管诱导建立肾间质纤维化的模型，分析Cyr61与MMP-3/TIMP-2比值的相关性，探讨Cyr61对肾间质纤维化发展过程的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

80只4周龄清洁级SD雄性幼年大鼠，体重(150±50)g，随机分为2组，假手术组和模型组各40只，假手术组寻找到左侧输尿管后仅游离处理,不做结扎和离断，模型组大鼠以10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术板，剪毛后常规消毒、铺巾，在无菌条件下选取左侧脊柱旁1.5cm，左肋下1cm处做一纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织、钝性分离肌肉，切开后腹膜，沿左肾下极寻找左输尿管，用玻璃分针将左输尿管托起并将其游离，紧贴左肾下极结扎近端输尿管，结扎输尿管远端后从中间离断；逐层缝合、消毒。分别于术后1、3、7、14d，每组各处死10只幼年大鼠，取左肾标本，用10%中性甲醛充分固定后，石蜡包埋待用。

1.2 主要试剂

兔抗大鼠多克隆抗体Cyr61、MMP-3、TIMP-2，免疫组化试剂盒及DAB显色盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病理学染色检查及分析

肾组织经固定、脱水、石蜡包埋后，切成3μm厚度的组织标本，行HE 染色来评估肾小管间质损伤程度，改良 Masson三色法染色观察肾小管损害及肾间质纤维化。在高倍镜下(×400)每张标本的皮质部位，随机切10个不含肾小球的不重叠的视野，按文献[5]描述的方法进行半定量评分。

1.3.2 肾标本免疫组化染色及分析

采用SABC法，按说明书步骤进行(稀释一抗比例Cyr61：1：80，MMP-3:1：100，TIMP-2：1:150)。在高倍镜下(×400)，每张切片随机选取10个肾小管间质的视野， DAB显色的阳性区域可出现对比鲜明的棕黄色(均质或者颗粒)为特异性阳性反应。用图像分析仪对所选取的图像进行分析，计算各因子阳性表达的累计光密度值(IOD)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠肾小管及间质病理学改变

HE和Masson染色光镜下检查可见模型组大鼠术后1d，远端肾小管无明显扩张，肾小球结构正常；术后3d，远端肾小管可见明显扩张，肾间质可见轻度水肿，间质内可见少量的炎性细胞浸润，肾间质未见明显纤维化；术后7d各级肾小管均出现明显扩张，部分肾小管管腔内可见少许脱落的上皮细胞及蛋白管型，间质增宽中可见增多的炎性细胞及部分间质的纤维化；术后第14天可见近端、远端肾小管及集合管成囊状扩张，肾小管结构严重破坏，肾间质中大量炎性细胞浸润及间质的纤维化。见图1。

图1 模型组与假手术组同一时间点肾小管间质损害程度

*P<0.05；表示模型组内各时间点肾小管间质损害程度相比，﹟P<0.05。

2.2 实验大鼠肾间质中Cyr61阳性的表达

光镜下，Cyr61在假手术组肾小管上皮细胞少量表达，在肾小球无表达。模型组术后1d肾小管间质中Cyr61表达明显增加，主要集中在近曲肾小管中。术后第7天Cyr61的表达明显减少，阳性表达较术后3d及术后1d明显减少，其差异具有统计学意义(P<0.05)；术后14d，Cyr61在肾小管间质中呈现低表达(P<0.05)。见图2 。

图2 各组大鼠肾组织中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表达

*P<0.05；表示模型组内各时间点相比，﹟P<0.05。

2.3 各时间点实验大鼠MMP-3、TIMP-2阳性的表达

光镜下，假手术组MMP-3在远端肾小管上皮细胞的胞浆中及肾小球上皮细胞可见少量的表达。模型组在术后第1天可见到MMP-3的表达明显增多，术后7天，MMP-3的表达到高峰后逐渐降低。TIMP-2在假手术组肾小管上皮细胞中可见少量的表达，模型组主要表达在肾小管、集合管的上皮细胞、肾间质细胞中，肾小球可见少量表达，其表达随梗阻时间的延长表达呈现增长趋势。见图2。

2.4 肾小管的损伤程度、Cyr61与MMP-3/TIMP-2比值相关性的分析

观察各时间点肾小管间质的损害程度与Cyr61的表达发现，二者之间呈负相关(r=-0.737，P<0.05)，即随着肾小管损害程度的增加，Cyr61的表达逐渐降低;而Cyr61的表达与MMP-3/TIMP-2比值之间呈正相关(r=0.890,P<0.05)。见图3。

图3 相关分析散点图

3 讨论

大量的研究证实：肾小管间质损害的程度与肾功能的下降密切相关，其损害的严重程度也是判断各种肾脏疾病预后的重要指标。早期判断肾小管损害程度并尽早的进行干预治疗，对肾脏病患儿的康复起着决定性的意义。

有研究表明，在肾缺血损害后3～6 h近端肾小管直部即可迅速诱导Cyr61的表达[6]。本实验发现，在梗阻损害发生后，模型组大鼠肾组织中Cyr61首先在近端肾小管曲部大量表达，随梗阻时间的延长，在远端肾小管、集合管均有表达。实验中，我们观察到各时间点中Cyr61的表达与肾小管及间质的损害程度呈负相关，近曲小管是物质重吸收和利用的部位，也是药物损伤的部位，这表明Cyr61作为一种即刻蛋白，可能在肾损伤的早期发挥一定的负向调节作用，这与前人的研究一致[7]，同时这种负向调节作用可能也持续存在于梗阻所致的肾纤维化过程中。

肾纤维化的特点是ECM成分的过多积累和沉淀[8]。MMPs及其组织抑制因子TIMPs是调节ECM 动态平衡的最重要的酶系之一，其活性的变化及比例的失衡是最终导致肾脏纤维化发生的主要机制。赵丽君等人在2013年的研究中显示大鼠单侧输尿管梗阻后出现的肾间质纤维化病理损害和与 MMP-3/TIMP-2 的表达失衡有关[9]。本实验通过免疫组化的方法，观察MMP-3、TIMP-2在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达与赵丽君等人的研究相符，但本研究发现MMP-3的表达在梗阻后的7天就出现了下降，在梗阻后14天则出现了明显的下降。其原因主要考虑为：①所取样本量不同；②标本部位存在差异；③观察阳性表达的选取的时间点存在差异。

LI-GANG JIE等人在类风湿关节炎滑膜细胞的增殖与侵袭试验中观察到Cyr61可以显著上调MMP-3的表达[10]。在我们的研究中同样也观察到MMP-3的增高，同时我们的实验还发现，随着梗阻时间的延长，Cyr61的表达同MMP-3/TIMP-2的比值存在着正相关，这表明Cyr61可能也通过调控MMP-3/TIMP-2的平衡，在肾纤维化的过程中发挥重要作用。研究中我们还发现，各时间点假手术组中MMP-3/TIMP-2的比值几乎无差异，而模型组中，随着梗阻时间的延长其比值出现下降，这个比值是否可以作为判断肾小管损害程度及判断预后的标准，在阻断肾间质纤维化的发展过程中，为临床预防和阻断肾间质纤维化发生、发展提供一个新的治疗环节，未来我们需要更大量的实验数据进一步的研究验证。

[1]张承彦.CCN家族在纤维化中的研究进展[J].基础医学与临床，2014,34(3)：410-413

[3]田寿福，王筱霞，汪年松.CCN1与肾脏疾病的研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志，2011,12(9)：831-833

[4]徐岩，国敏，董晖，等.富含胱氨酸蛋白61对缺氧状态下肾小管上皮细胞的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2015，31(6):451-455

[5]李丽，王长山，李怀荆，等.黄茂当归合剂对梗阻性肾病大鼠E-cadherin和a-SMA表达的影响[J].黑龙江医药科学，2015，38(6)：4-8

[6]李荣山.急性肾损伤的生物标志物[J].中华肾病研究杂志，2013,2 (3)：134-137

[7]Chun-Fu Lai,Shuei-Liong Lin,Wen-Chih Chiang,et al.Blockade of cysteine-rich protein 61 attenuates renal inflammation and fibrosis after ischemic kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,11(307):581-592

[8]刘中柱，潘明阳，刘艳妹，等.厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻人鼠肾间质纤维化干预作用[J].黑龙江医药科学，2014，37 (2) :50-51

[9]赵丽君，崔建军，李秀花.MMP-3和TIMP-2在UUO大鼠肾间质的表达[J].中国中西医结合肾病杂志，2013，14(3):212-214

[10]LI-Gang jie,RUN-Yue huang，WEI-Feng sun,et al.Role of cysteine-rich angiogenic inducer 61 in fibroblast-like synovial cell proliferation and invasion in rheumatoid arthritis[J].Molecular Medicine Reports,2015,11:917-923

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015_021。

王淑静(1988～)女， 河南濮阳人，在读硕士研究生。

王丽敏(1964～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail:wanglimin6518@163.com。

R693+.2

A

1008-0104(2016)05-0033-03

2016-05-26)