活性维生素D3对UUO模型大鼠肾间质骨形成蛋白-7表达的影响 ①

刘艳姝，刘中柱，史为伍，牛效清，张国艳，赵春艳，蔡天蕊

(佳木斯大学附属第一医院肾内科，黑龙江 佳木斯 154003)



活性维生素D3对UUO模型大鼠肾间质骨形成蛋白-7表达的影响①

刘艳姝，刘中柱，史为伍，牛效清，张国艳，赵春艳，蔡天蕊

(佳木斯大学附属第一医院肾内科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：研究活性维生素D3在肾小管间质纤维化病理过程中对骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)表达的影响。方法：36只清洁级雄性Wistar大鼠，随机分为活性维生素D3治疗组(n=12)、UUO模型组(n=12)、假手术组(n=12)。活性维生素D3治疗组给予罗盖全(骨化三醇)灌胃，持续28d。假手术组及UUO模型组给予等量生理盐水灌胃。实验结束时，测定各组大鼠血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)值，肾脏病理检查造模侧肾小管间质纤维化程度，免疫组化法测定BMP-7在各组大鼠造模侧肾脏的表达。结果：①UUO模型组的肾间质纤维化面积高于活性维生素D3治疗组(P<0.05)。②BMP-7在假手术组明显高于UUO模型组和活性维生素D3治疗组，而活性维生素D3治疗组的BMP-7的表达高于UUO模型组(P<0.05)。结论：①BMP-7参与了肾间质纤维化的发生发展。②活性维生素D3可以上调BMP-7的表达，抑制肾间质纤维化。

肾间质纤维化；单侧输尿管梗阻；骨形成蛋白-7；活性维生素D3

肾间质纤维化(RIF)是由多种致病因子共同作用，导致细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡为主要特征,最终引起肾间质纤维化。肾间质纤维化是肾小管上皮细胞、血管内皮细胞损伤，发生肾间质炎症反应，炎症细胞浸润，促使产生过多的ECM成分，ECM合成和降解的动态平衡被破坏，导致肾间质ECM积聚,促进纤维化的发生发展[1]。BMP-7在肾脏发育过程中的主要是诱导间充质细胞向正常肾组织结构的转化[2]，是重要的肾脏保护细胞因子。活性维生素D3经典作用是参与体内钙磷代谢调节。近年研究发现，活性维生素D3能够减轻肾小管间质纤维和纤维化，延缓肾功能减退等作用。本实验通过建立单侧输尿管梗阻大鼠模型，造成大鼠肾间质纤维化，并给予活性维生素D3干预治疗，观测肾脏病理变化、免疫组化结果及对肾脏组织中BMP-7表达的影响，为活性维生素D3在慢性肾脏疾病中作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型的建立及分组

36只Wistar雄性大鼠，体重180～220g，随机分为3组，活性维生素D3治疗组(n=12)、UUO模型组(n=12)、假手术组(n=12)。将各组大鼠称重，进行5%的水合氯醛6mL/kg腹腔注射麻醉，备皮消毒后行腹中线左侧切口，游离左侧肾脏及输尿管，并于输尿管上1/3处手术缝线上下结扎两处，手术后将肾脏置于原位,逐层缝合。假手术组分离输尿管不做结扎，手术过程与其它两组相同。活性维生素D3治疗组给予活性维生素D33ng/100g溶于0.1mL花生油中每日灌胃一次，假手术组和UUO模型组给予每日一次0.1mL生理盐水灌胃，直到实验结束。各组大鼠分别各取6只于单侧输尿管结扎术后第14、28天测量大鼠体重、內眦静脉取血1～2mL，送实验室测定Scr和BUN，然后处死大鼠，迅速取出左侧肾脏，去除被膜，延冠状位纵行切开， 10%中性福尔马林固定液固定，48h石蜡包埋，将肾组织切成切片。

1.2 肾功能指标

血液标本送佳木斯大学附属第一医院生化室，检测血肌酐、血尿素氮。

1.3 肾脏的病理学检查及免疫组化染色

将石蜡包埋的肾组织，做2μm连续切片分别进行HE、Masson 染色。每只动物的切片随机取20个视野，之后取视野的中央，在200倍镜下留取图像。计算每个视野下蓝染区域占总视野面积的百分比，取均值。采用SABC法测定肾组织中BMP-7的表达，DAB棕黄色反应呈阳性。细胞浆着棕黄色者为阳性表达细胞。BMP-7蛋白表达：随机选取15个高倍镜视野(×400)，分析每个视野下棕黄色累积光密度值，计算均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 梗阻侧肾脏组织大体观察

假手术组大鼠肾脏组织红润，大小正常。UUO 组和活性维生素D3治疗组梗阻侧肾脏体积明显增大，纵向剖开后，可见肾内积水，积液清亮透明，可见血块以及黄色半透明的液体，肾实质变薄，肾盂肾盏高度扩张，穹隆部乳头变平钝，肾盏乳头受压，部分凹陷。

2.2 各组大鼠血肌酐、血尿素氮结果

各时间点血肌酐、血尿素氮水平活性维生素D3治疗组与假手术组、UUO组之间差异无显著性(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血肌酐、血尿素氮结果±s)

2.3 各组大鼠肾脏病理检查结果

HE染色镜检结果：假手术组肾小球、小管结构正常，小管周围肾间质无增宽。UUO模型组和活性维生素D3治疗组在术后第14天，光镜下可见肾间质增宽、肾小管结构紊乱、变形，多数小管扩张、灶性萎缩，肾小管上皮细胞弥漫性肿胀、空泡变性。术后28d，小管周围肾间质明显增宽，有散在或多灶性单核、淋巴细胞浸润增多和间质纤维化程度加深。活性维生素D3治疗组，在术后第14天、28天都有肾间质增宽，炎症细胞浸润，与UUO模型组相比，同时间点肾小管间质病变程度减轻。

Masson染色镜检结果：活性维生素D3治疗组与UUO模型组在同时间点相比，间质增宽程度、肾小管扩张和胶原沉积程度都显著减少(P<0.05)，见表2。

表2 大鼠体内Masson染色肾间质纤维化面积百分比±s)

*与假手术组比较，P<0.05，#与UUO模型组比较，P<0.05。

2.4 免疫组织化学结果半定量分析

假手术组中，大鼠肾间质BMP-7高度表达。与假手术组同时间相比，UUO模型组随梗阻时间延长，BMP-7表达逐渐降低。活性维生素D3治疗组BMP-7表达也有降低，但明显高于同时间点UUO模型组(P<0.05)。见表3。

表3 免疫组织化学各组BMP-7阳性表达面积百分比±s)

*与假手术组比较，P<0.05，#与UUO模型组比较，P<0.05。

3 讨论

肾间质纤维化是各种肾脏疾病慢性进展直至终末期的共同病理表现，同时也是所有肾脏疾病慢性发展的最终结果。涉及多种细胞、细胞因子、生长因子、细胞外基质及其相互作用，刺激系膜细胞产生大量致纤维化因子，加重肾间质纤维化。我们在以往的研究中发现，活性维生素D3治疗UUO大鼠肾组织结缔组织生长因子表达减少，肾间质纤维化程度下降[3]。

本实验中，假手术组大鼠肾间质BMP-7高度表达，主要分布于肾小管及肾间质，在升支小管上皮、远曲小管、集合管均有表达，髓质区表达明显高于皮质区的表达。UUO模型组与假手术组同时间相比，随梗阻时间延长，BMP-7表达逐渐降低，有些阳性区转阴。说明BMP-7参与了肾间质纤维化的过程。BMP-7是常见的抑制纤维化因子， BMP-7的表达与TGF-β1和肾间质纤维化程度呈负相关，随梗阻时间的延长，表达逐渐减少。

BMP-7对肾脏的保护机制可能是①维持肾小管上皮细胞表型：研究表明，肾小管上皮细胞向间充质细胞的转分化作用在肾间质纤维化中有重要作用[4]，而BMP-7可在基因水平上拮抗TGF-β1，恢复肾小管上皮细胞的表达,抑制EMT的发生。②促进细胞外基质的降解：体外实验的肾小球系膜细胞中，加入TGF-β1后,纤连蛋白和胶原纤维等细胞外基质的增强，同时加入BMP-7则抑制TGF-β1诱导的细胞外基质的表达,而细胞外基质的mRNA水平并未发生明显变化,说明BMP-7主要在细胞外基质的降解方面，拮抗TGF-β1的作用。此外，BMP-7还可能通过抑制炎症反应、改善血流动力学，减轻肾纤维化和肾脏保护作用[5]。

本实验通过将实验大鼠左侧输尿管结扎，引起肾脏泌尿系统的阻塞，肾皮质血流量降低，肾脏发生应激反应，大量细胞因子被激活发生相应作用。随着梗阻时间延长，纤维化程度加深。与UUO模型组相比，活性维生素D3治疗组的病理改变减轻，免疫组化测定BMP-7的表达增加，说明活性维生素D3具有保护肾脏作用，可能通过上调BMP-7延缓肾间质纤维化的进程。维生素D可调节免疫功能，调节RAS系统，抑制炎症因子表达和炎症反应，通过调节SmaD3和转化生长因子通路，减少促纤维生成细胞因子的产生[6]。

通过本实验，我们推论活性维生素D3对肾间质纤维化模型大鼠的防治作用机制之一可能是上调BMP-7的表达，对肾间质纤维化有防治作用。

[1]刘艳姝，刘文思，刘中柱,等.活性维生素D3抑制UUO模型大鼠肾间质纤维化的研究及其对TGF-β1、α-SMA表达的影响[J].黑龙江医药科学， 2013,36(2)：72-73

[2]Zeisberg M,Kalluri R.The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis[J].J Mol Med,2012,82(3):175-181

[3]刘艳姝，于晓崴，刘中柱，等.CTGF在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达及活性维生素D3干预治疗的研究[J].黑龙江医药科学，2012,35(4)：22-23

[4]LiT,Surendran K,ZawaidehMA,et al.Bone morphogenetic protein 7:a novel treatment for chronic renal and bone disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2010,13(4):417-422

[5]Norman J T,Clark I M,Garcia P L,Hypoxia promotes fibrogenesis in human renal fibroblasts[J].Kidney Int,2010,58(4):2351-2366

[6]Wang S,Hirschberg R.Bone morphogenetic protein-7 signal transforming growth factor beta in mesangial cells[J].BiolChem,2011,279(22):232-236

The influence of active vitamin D3on the expression BMP-7 in UUO model rat

LIUYan-shu,LIUZhong-zhu,SHIWei-wu,NIUXiao-qing,ZHANGGuo-yan,ZHAOChun-yan,CAITian-rui

(Department of Nephrology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective：To observe the expression and distribution of the Bone morphogenetic protein-7(BMP-7) in kidney tissues in the process of renal interstitial fibrosis; to explore the influence of active vitamin D3on renal tubule interstitial fibrosis and on the expression BMP-7 in UUO model rat.Methods:36 SD rats were randomly divided into active vitamin D3treatment group (n=12),UUO model group (n=12),sham operated group (n=12).The expression and distribution of the BMP-7 in the kidney tissues were detected by immunohistochemistry.Results:The expression of BMP-7 decreased in UUO model group and in active vitamin D3treatment group compared with the tofsham operated group.The expression of BMP-7 in UUO model group was lower than that in the active vitamin D3treatment group(P<0.05).Conclusion：①BMP-7 take part in renal interstitial fibrosis.②Active vitamin D3can increase the expression of BMP-7 and relieve renal interstitial fibrosis.

renal interstitial fibrosis; unilateral ureteral obsrtution; bone morphogenetic protein-7; active vitamin D3

黑龙江教育厅科研项目，编号：12531702。

刘艳姝(1971～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师，硕士研究生导师。

R693

A

1008-0104(2016)05-0021-03

2015-10-15)